Главная > Биология > Гіпотеза світу РНК
Гіпотеза світу РНК20-01-2012, 22:45. Разместил: tester2 |
|
Зміст Введення I. Сучасні уявлення,характеризують концепцію В«Світ РНКВ» I.1 Зворотня транскрипція I.1.1 Реплікація теломерна ділянокеукаріотичних хромосом I.1.2 Механізм зворотної транскрипції I.2 Функціональні можливості РНК I.3 тмРНК I.4 Інтерференція РНК I.5 Структура РНК-вмісних стресовихгранул I.6 Поява концепції В«Миру РНКВ» I.6.1 рібозімов I.6.2 Виникнення стародавнього світу РНК Висновок Список літератури Введення Майжепівстоліття тому, у 1953 р., Д. Уотсон і Ф. Крик відкрили принцип структурної(Молекулярної) організації генного речовини - дезоксирибонуклеїнової кислоти(ДНК). Структура ДНК дала ключ до механізму точного відтворення -редуплікації генного речовини. Виникла нова наука - молекулярна біологія.Була сформульована так звана центральна догма молекулярної біології: ДНКв†’ РНК в†’ білок. Сенс її полягає в тому, що генетична інформація,записана в ДНК, реалізується у вигляді білків, але не безпосередньо, а черезспорідненого полімеру - рибонуклеїнової кислоту (РНК), і цей шлях віднуклеїнових кислот до білків незворотній. Таким чином, ДНК синтезується на ДНК,забезпечуючи власну редуплікацію, тобто відтворення вихідногогенетичного матеріалу в поколіннях; РНК синтезується на ДНК, в результатічого відбувається переписування, або транскрипція, генетичної інформації вформу численних копій РНК; молекули РНК служать матрицями для синтезубілків - генетична інформація транслюється в форму поліпептидних ланцюгів. Прицьому виникає виразне враження про значно більш різноманітнихфункціональних можливостях рибонуклеїнових кислот у порівнянні з ДНК,існування якої пов'язано виключно з необхідністю збереження іпередачі з покоління в покоління спадкових ознак. рибонуклеїнової кислоти(РНК), присутні в клітинах як про-, так і еукаріотів, бувають трьох основнихтипів: інформаційна (матрична, мРНК), транспортна (тРНК) і рибосомна(РРНК). У ядрі клітин еукаріотів міститься РНК четвертого типу - гетерогеннаядерна РНК (гяРНК). У деяких вірусів РНК служить носієм генетичноїінформації. I. Сучасні уявлення,характеризують концепцію В«Світ РНКВ» I.1 Зворотня транскрипція Сучасні знання проструктурному і функціональному різноманітності РНК вже не вкладаються в ті канонічніуявлення про їх роль в реалізації генетичної інформації, які виниклина самому початку розвитку молекулярної біології. Уявлення про те, що РНКслужить тільки інструментом трансформації генетичної програми (генотипу),закладеної в структурі ДНК, в конкретний фенотип, формований різноманітністюбілків, було значною мірою зруйновано після відкриття зворотноїтранскрипції. Виявилося, що РНК може служити матрицею не тільки длявідтворення своєї власної структури в РНК-вмісних вірусних геномах,але і для біосинтезу ДНК у вищих організмів. Цей процес також використовують вході свого розвитку багато вірусів, у тому числі сумнозвісні онкогеннівіруси і ВІЛ-1, що викликає СНІД. РНК виконує роль матричної молекули впроцесах зворотної транскрипції (біосинтезі ДНК на матриці РНК) і своєївласної реплікації у РНК-вмісних вірусів і фагів. В процесі зворотноготранскрипції роль затравки, необхідної для синтезу комплементарної ланцюга ДНК,виконує тРНК. Матричні властивості РНК реалізуються в процесі нарощуваннятеломерна повторів в молекулах ДНК: РНК-матриця є найважливішим компонентомтеломераз - ферментів, що здійснюють синтез теломерна ділянок ДНК вхромосомах. I.1.1 Реплікація теломерна ділянокеукаріотичних хромосом На кінцях хромосомеукаріот знаходяться спеціалізовані повторювані послідовності ДНК,отримали назву теломерна ДНК, а містять її кінці хромосом -теломеромі. У клітинах тварин кількість хромосом, а отже, ітеломерна ділянок невелика - вони складають лише невелику частину від усіхінших послідовностей. Використання в якостіоб'єкта дослідження теломерна ДНК ресничной інфузорії Tetrahymena thermophila, в клітинах якої знаходяться десяткитисяч дрібних хромосом, а отже, і безліч теломер, показало, щотеломери побудовані з коротких (містять по 6 - 8 нуклеотидних залишків)багаторазово повторюваних послідовностей (блоків). При цьому один ланцюг ДНКзбагачена залишками гуанілова кислоти (G-багата ланцюг, у тетрахімени - це блок ТТGGGG), а комплементарна її ланцюгзбагачена залишками цітіділовой кислоти (С-багата ланцюг). Теломерна ДНКлюдини побудована з ТТАGGG-блоків,тобто відрізняється від найпростіших всього лише одним нуклеотидів у повторі. З ТТАGGG-блоків побудовані теломерна ДНК (їхбагаті С-ланцюга) всіх ссавців, рептилій, амфібій, птахів і риб. Універсальнийі теломерной повтор (ТТТАGGG) увсіх рослин. Теломери відіграють важливу рольу створенні специфічної архітектури та внутрішньої впорядкованості клітинногоядра. Вони запобігають деградацію і злиття хромосом, а також відповідальні заїх прикріплення до спеціальної внутрішньоклітинної структурі (своєрідного скелетуклітинного ядра). Механізми реплікаціїтеломерна ділянок еукаріотичних хромосом і центральних областей ДНКпринципово розрізняються. Всі відомі ДНК-полімерази, що є ферментамискладного репликативного комплексу еукаріот, нездатні повністю реплікуватикінці лінійних молекул ДНК. Відомо, що ДНК-полімерази, синтезуючи дочірню ниткуДНК, прочитують батьківську нитку в напрямку від її З'-кінця до 5'-кінця.Відповідно дочірня ланцюг синтезується в напрямку 5 'в†’ 3'. Крімтого, ДНК-полімераза починає синтез тільки зі спеціального РНК-праймера,комплементарного ДНК. Після закінчення синтезу ДНК РНК-праймери видаляються, апропуски в одній з дочірніх ланцюгів ДНК (відстаючої) заповнюються ДНК-полімеразою ОІ.Однак на З'-кінцевих ділянках ДНК такий пропуск заповнений бути не може, ітому вони залишаються однотяжевимі, вЂ‹вЂ‹а їх 5'-кінцеві ділянки -недорепліцірованнимі. Отже, при кожному раунді реплікації хромосомибудуть зменшуватися на 10 - 20 нуклеотидів (у різних видів розмір РНК-затравокрізний), і в першу чергу скорочувати довжину теломерна ДНК. Виникла проблемаВ«Кінцевий недореплікаціі ДНКВ». У разі реплікації кільцевої бактеріальних ДНКцієї проблеми не існує, так як перші по часу утворення РНК-праймеривидаляються ферментом, який одночасно заповнює образующуюся пролом шляхомнарощування З'-ОН-кінця зростання ланцюга ДНК, спрямованої в В«хвістВ» удаляемомуПраймер. Проблема недореплікаціі З'-кінців лінійних молекул вирішуєтьсяеукаріотичних клітинами за допомогою спеціального ферменту - теломерази. Цейфермент був виявлений вперше в 1985 р. у інфузорії Tetrahymena thermophila, а згодом - в дріжджах,рослинах і у тварин, у тому числі в яєчниках людини і безсмертних лініяхракових клітин НеLа. Теломераза єДНК-полімеразою, добудовують 3'-кінці лінійних молекул ДНК хромосом короткими(6 - 8 нуклеотидів) повторюваними послідовностями (у хребетних ТТАGGG). Згідно номенклатурі, цейфермент називають ДНК-нуклеотидилэкзотрансферазой, або теломерной термінальнійтрансферази (мол. маса 103-133 кДа). Крім білкової частини теломеразамістить РНК, що виконує роль матриці для нарощування ДНК повторами. Довжина теломерной РНКколивається від 150 нуклеотидів - у найпростіших до 1400 нуклеотидів - у дріжджів, улюдини - 450 нуклеотидів. Наявність у молекулі теломеразиРНК-послідовності, за якою йде матричний синтез фрагмента ДНК,дозволяє віднести теломеразу до своєрідної зворотної транскриптазе, тобтоферменту, здатному вести синтез ДНК по матриці РНК. Основне призначеннятеломерази - синтезувати тандемної повторюються блоки ДНК, з яких складаєтьсяG-ланцюг теломерна ДНК. Матричнийділянку представлений в теломеразной РНК тільки один раз. Його довжина не перевищуєдовжину двох повторів в теломерна ДНК. Механізм синтезутеломерна повторів, що каталізується теломеразою: На першій стадії(Зв'язування теломери) відбувається комплементарна взаємодія частиниматричного ділянки теломеразной РНК з 3'-кінцевим виступаючим одноланцюговихсегментом ДНК хромо...сом. При цьому З'-кінцевий фрагмент ДНК служить затравкою дляподовження цієї ДНК на РНК-матриці. На стадії елонгації виступаюча ланцюг ДНКподовжується до кінця матриці. Ця реакція здійснюється РНК-залежноїДНК-полімеразної активністю теломерази. Після подовженнявиступаючої ланцюга ДНК до кінця матриці відбувається транслокація, тобто переміщенняматриці і білкових субодиниць ферменту на заново синтезований кінецьтеломеразной ДНК, і весь цикл повторюється знову. Після завершення подовженняодноцепочечной З'-кінцевій теломерной послідовності другий ланцюг ДНК(С-ланцюг) добудовується за допомогою звичайної ДНК-полімерази. Таким чиномвідбувається вирішення проблеми кінцевий реплікації ДНК у еукаріот.
Рис. 1. Реплікаціятеломерна ділянок еукаріотичних хромосом (Цитовано за [1]): А - виникнення недорепліцірованія5'-кінця лінійної хромосоми і синтез на цьому кінцевій ділянці теломерна ДНК здопомогою теломерази; Б - основні етапи синтезу теломернаповтору теломеразою I.1.2 Механізм зворотної транскрипції На зворотної транскрипціїзасноване розмноження ретровірусів (віруси, у яких геномом служить не ДНК, якзазвичай, а РНК) і ретротранспозонів (є транспозіціоннимі елементами,які не мають віріони частинок, і, отже, на відміну від ретровірусів,не можуть незалежно В«переносити себеВ» між клітинами), освіта такзваних ретропсевдогенов (або процессірованние псевдогени церетропоследовательності, які втратили свою функцію, вони несуть всі ознакифункціональних ретропоследовательностей, але мають молекулярні дефекти, якіне дають їм експресуватися) та добудовакінчиків хромосом (теломер), коротшають при кожному клітинному поділі. Якщо молекула ДНК пошкоджена - наприклад, піддалася розриву(Double-strand break, DSB) - для її лагодження необхідна матриця, в якійпослідовність нуклеотидів відповідає вихідному, В«правильномуВ» станомпошкодженої ділянки. Раніше вважалося, що в якості таких матриць завждивикористовуються інші молекули ДНК. Пізніше було встановлено, що іноді ціДНК-матриці синтезуються шляхом зворотної транскрипції на основі РНК за участюретротранспозонів. При вивченніретровірусів, геном яких представлений молекулами одноланцюжкові РНК, буловиявлено, що в процесі внутрішньоклітинного розвитку ретровірус проходить стадіюінтеграції свого геному у вигляді дволанцюгової ДНК в хромосоми клітини-хазяїна.У 1964 р. Темін висунув гіпотезу про існування вірусспеціфічного ферменту,здатного синтезувати на РНК-матриці комплементарних ДНК. Зусилля,спрямовані на виділення такого ферменту, увінчалися успіхом, і в 1970 р.Темін з Мізутані, а також незалежно від них Балтімор відкрили шуканий фермент впрепараті позаклітинних віріонів вірусу саркоми Рауса. Дана РНК-залежнаДНК-полімераза отримала назву зворотній транскриптаза, або ревертаза. Кожен віріон (повноцінна вірусна частка, що складається з нуклеїновоїкислоти та білкової оболонки) ретровірусів містить дві ідентичні ланцюга РНКрозміром від 8000 до 10 000 нуклеотидів. Області 5'-і 3'-кінців обох ланцюгівмодифіковані, як у всіх еукаріотичних мРНК (5'-кепи, З'-поліаденіловиехвости). Вірусні РНК мають 5 структурних елементів: 1) прямі повтори на 5'-іЗ'-кінцях РНК (R); 2)послідовність з 80 - 120 нуклеотидів, що знаходиться близько 5 кінцевогоповтору (U5); 3) послідовність з 170 -1200 нуклеотидів близько З'-кінцевого повтору (U3); 4) послідовність з 15 20 нуклеотидів (Р), вмежах якої клітинна тРНК комплементарно взаємодіє з ретровірусноїРНК, що створює праймер для синтезу перших ланцюга ДНК; 5) сегмент Pu, що знаходиться безпосередньо передповтором U3 і є сайтом дляпраймування другій ланцюга ДНК - такий сегмент однаковий у РНК всіх ретровірусівпевного типу. Етапи зворотноготранскрипції: 1. НарощуваннятРНК-праймера на матрицях U5 і R в напрямку 3 'в†’ 5'. РольРНК-праймера виконує одна з клітинних тРНК (наприклад, триптофанового,проліновая і т.д.). На відстані приблизно 100 - 200 нуклеотидів від 5'-кінцяРНК (для кожного вірусу - це величина постійна) є ділянка,комплементарний З'-кінцевій послідовності молекули тРНК, якийвикористовується в якості затравки. Ця ділянка зазвичай позначають як pbs (від англ.primer binding site ділянку зв'язування затравки). Зворотній транскриптазасинтезує сегмент ДНК, комплементарний 5'-кінцевий послідовностівірусної РНК. Цей сегмент прийнято називати (-) В«strong-stopВ» ДНК,оскільки синтез ДНК після завершення копіювання 5'-кінця матриці тимчасовозупиняється. (-) В«Strong-stopВ» ДНК містить послідовності,комплементарні концевому району R ірайону U5. Таким чином, синтез ДНКпочинається недалеко від 5'-кінця матриці і утворюється короткий продукт. Але цейкороткий продукт (-) В«strong-stopВ» має послідовність,комплементарну також і З'-кінця вірусної РНК, а як відомо, для зняттяДНК-копії з З'-кінця матриці завжди потрібно праймер. У ретровірусівкомплемент З'-кінця матриці виробляється в В«зручномуВ» місці, а потім переноситьсяна В«своєВ» місце. Це відбувається наступним чином: 5'-кінець вірусної РНК,створюючий дуплекс з (-) В«strong-stopВ» ДНК, руйнується під впливомпритаманною зворотній транскриптазі активності РНКази Н. 2. РНКаза Н, специфічнадо РНК у складі гібридного РНК-ДНК дуплексу, розщеплює сегмент РНК цьогодуплексу. В результаті (-) В«strong-stopВ» (RU5) виявляється в однониткових формі і може взаємодіятиз З'-кінцем (з ділянкою R) тієїж самої або іншої молекули вірусної РНК, оскільки на З'-кінці РНК єповтор R.. 3. Новосинтезованихкороткий ланцюг ДНК разом з праймером В«перестрибуєВ» на З'-кінець матриці івзаємодіє там з комплементарним їй ділянкою К. 4. Ланцюг ДНК подовжується, вяк матриці використовується інша частина вірусної РНК. На цій стадії вякості затравки виступає вже (-) В«strong-stopВ» ДНК; елонгація затравки призводить досинтезу (-) ланцюга ДНК, в якій відсутній комплемент району RU5, оскільки відповідна ділянка(+) Матриці був зруйнований РНКази Н. 5. До моменту завершеннясинтез перших ланцюга ДНК велика частина вірусної РНК руйнується РНКази Н. 6. Синтез З'-кінця другоїланцюга ДНК. 7. Видалення тРНК ізалишився ділянки вірусної (+) РНК РНКази Н. 8. Другий стрибок, врезультаті якого новосинтезованих другий ланцюг ДНК комплементарновзаємодіє з тРНК-зв'язує послідовність перших ланцюга. 9. Подовження З'-решткожній ланцюга, освіта дуплексу ДНК. Вся послідовністьреакцій протікає без явного участі ферментів реплікації клітини-хазяїна(Топоізомерази, ХЕЛІКАЗИ, ПРАЙМАЗИ, ДНК-зв'язуючого білка, лігази і т.д.). Прицьому слід зазначити, що молекули вірусних ДНК довше молекул вірусних РНК,які послужили матрицею для зворотної транскрипції. Дійсно, до 5'-кінця(+) Ланцюга вірусної ДНК додалася послідовність U3, а до 3-кінця цього ланцюга - послідовність U5. В результаті на кінцях молекуливірус специфічної ДНК з'явився довгий (кілька сотень нуклеотидів) кінцевийповтор (ДКП або LTR.), що маєструктуру U3U5.
Рис.2. Схема зворотноготранскрипції ретровірусної РНК з утворенням двуцепочечной ДНК (Darnell J., et.al. Molecular Cell Biology. - NY: Scientific Amer. Books,1986. - P. 1052) Синтез ДНК на РНК-матриціin vitro і ревертаза використовується в генетичній інженерії для синтезугенів і їх фрагментів, а також цілеспрямованого синтезу на матричних РНКкомплементарних молекул ДНК (кДНК) для розшифровки первинної структури РНК ібілків.
Рис. 3. Схема отриманнякДНК з використанням ревертази вірусу і трьох додаткових ферментів: полі(А)-полімерази, фрагмента Кленова ДНК-полімерази I і Нуклеази S1.(Цитовано за) Реакцію зворотноїтранскрипції проводять в спеціально підібраних умовах з використаннямсильних інгібіторів РНКазной активності. При цьому вдається отримуватиповнорозмірні ДНК-копії цільових молекул РНК. В якості праймера при зворотномутранскрипції полі (А) - містять мРНК використовують олігo (dT)-праймер, а длямолекул РНК, які не мають З'-полі (А)-решт, - хімічно синтезованіолігонуклеотиди, комплементарні-кі...нцю досліджуваної РНК. Після синтезу на мРНКкомплементарної ланцюга ДНК і руйнування РНК (зазвичай застосовують обробку лугом)здійснюють синтез другого ланцюга ДНК. При цьому використовують здатність ревертазиутворювати на 3'-кінцях одноланцюгових кДНК самокомплементарние шпильки,які можуть виконувати функції праймера. Матрицею служить перший ланцюг кДНК.Дана реакція може каталізувати як ревертазой, так і ДНК-полімеразою IE. coli. Показано, що поєднання цих двох ферментів дозволяє підвищити вихідповноцінних дволанцюжкових молекул кДНК. По закінченні синтезу перша і другаланцюга кДНК залишаються ковалентно зв'язаними петлею шпильки, що служила праймеромпри синтезі другій ланцюга. Цю петлю розщеплюють ендонуклеазою S1, специфічноруйнуючої одноцепочечниє ділянки нуклеїнових кислот. Утворені при цьомукінці не завжди виявляються тупими, і для підвищення ефективності подальшого
Рис. Саме цяназву.Другий
Рис. 5.як UАА і UАG, які зазвичай впізнаються за допомогою фактора термінації.Можливо, для встановлення правильної ОРС тмРНК необхідний фактор термінації.Це припущення вимагає подальшого експериментального підтвердження. Здопомогою тмРНК клітка вирішує два завдання: з одного боку, звільняютьсязупинилися рибосоми, а з іншого, неправильні білки швидко розщеплюютьсяспецифічної протеазой, дізнавшись сигнальний пептид, який кодується матричної частиноютмРНК. тмРНК активно досліджується протягом останніх років. Це пов'язано звідкриттям процесу транс-трансляції, а саме з можливістю синтезу одногобілка на основі двох різних мРНК. Здатність тмРНК об'єднувати в одніймолекулі функції тРНК і мРНК і приєднувати аланін з тРНК-частини без звичайногокодон-антикодоновой взаємодії робить тмРНК цікавим об'єктомдосліджень. Крім того, відсутність тмРНК у вищих організмів вказує наможливість її використання в якості гарною мішені при створенні новихантибактеріальних засобів. Функція тмРНК особливо важлива для життєдіяльностібактерій при підвищених температурах. Відомо, що багато бактеріальніінфекції супроводжуються підвищенням температури, тому створення препарату,блокуючого функцію тмРНК, призведе до загибелі бактерій і не вплине набіосинтез білків людини. I.4 Інтерференція РНК Одним знайбільш важливих механізмів регуляції експресії генів є інтерференціяРНК. Регуляція експресії еукаріотичних генів може здійснюватися надекількох рівнях: під час транскрипції, на стадії процесингу РНК, притрансляції і на рівні дозрівання білка. Останнім часом у зв'язку з відкриттямявища інтерференції РНК велику увагу вчених привертаєпосттранскрипційна рівень регуляції. ІнтерференціяРНК - високоспецифічний механізм придушення експресії гена напосттранскрипційна рівні за рахунок деградації зчитаної з нього мРНК.Деградація мРНК відбувається в результаті комплементарного зв'язування комплексів,що містять малі інтерферують РНК (siРНК), які відносяться до сімейства малих РНК, і білки, у тому числіендонуклеази. Малі РНК - регуляторні некодуючі РНК розміром від 19 до 28н., що утворюються в клітці з довших дволанцюжкових РНК (дцРНК). МаліРНК можуть регулювати експресію генів не тільки за допомогою інтерференції, алетакож пригнічуючи трансляцію, транскрипцію або сприяючи видаленню гена-мішені зклітинного геному. Останнє спостерігається у деяких найпростіших в процесідозрівання макронуклеуса. Феномен інтерференції РНК виявлений у різнихеукаріотичних організмів, зокрема, в одноклітинних, нижчих грибів,рослин, нематод, комах, а також у хребетних, включаючи мишей і людини.Подібна висока консервативність механізму інтерференції РНК свідчить пройого великої значущості. І хоча функції деяких видів малих РНК досі невстановлені, припускають, що основна їх роль - захист геному клітини відвпровадження мобільних генетичних елементів (вірусів, транспозонів), а такожучасть в регуляції диференціювання багатоклітинних організмів. МаліРНК становлять значний інтерес для фундаментальної молекулярної біологіїі таких прикладних її областей, як біомедицина і біотехнологія. Одним знайбільш ефективних способів вивчення функції гена є аналіз фенотипуорганізмів, у яких цей ген не експресується. Існує ряд методів,дозволяють пригнічувати експресію певних генів, в тому числі, використанняантисмислової олігонуклеотидів, рибозимов, хімічних блокаторів, а такожруйнування потрібного гена у всьому організмі шляхом внесення відповіднихмутацій в зиготу. Однак ці методики або складні, або не завжди ефективні іне забезпечують повного сайленсінга гена (тобто придушення експресії) уекспериментальних моделях ссавців. На відміну від перерахованих методик,технології, засновані на явищі інтерференції РНК (деградація мРНК привведенні в клітину відповідних їм 81РНК або експресують їх конструкцій),прості у виконанні, ефективні і володіють великою специфічністю розпізнаваннямолекули-мішені. Виділяютьдва основних типи малих регуляторних РНК: малі інтерферують РНК (siРНК) і мікроРНК (miРНК). Біохімічно і функціональноце молекули практично нерозрізнені, і принцип їх підрозділи заснований на природіпопередників. siРНК - малідцРНК довжиною 19-25 п.н. утворюються з довгих дцРНК. miРНК - маліоцРНК довжиною 18-24 н. утворюються з внутрішньомолекулярних дволанцюжкових структур(Шпильок) РНК-попередниць, транскрібіруемих з генів, що містять повторюваніінвертовані послідовності (паліндроми). Запоходженням малі РНК можна розділити на екзогенні (індуковані абокодовані вірусами, або введені штучно) і ендогенні (що утворюютьсяпри транскрипції власних генів клітини). Сигналомдля ініціації інтерференції РНК служить поява в клітці екзогенної (вірусноїабо введеної в ході експерименту) або ендогенної (транскрибувати звласних генів клітини) дцРНК. Ефективність інтерференції РНК прямо залежитьвід довжини молекули дцРНК: чим довше дцРНК, тим більше siРНК утворюється, і тим більше число сайтів-мішеней намолекулі мРНК буде розпізнано. Мінімальний розмір дцРНК, достатній для індукціїінтерференції, - 26 п.н. Швидше за все, таке обмеження захищає від деградаціївласну клітинну мРНК з короткими внутрішньомолекулярними самокомплементарниміструктурами. дцРНК розпізнається і нарізається ферментом Dicer. Молекула Dicer міститьN-кінцевий хеліказний домен - РАZ, функція якого не зовсім ясна,парні РНКазние домени, а також розташований на С-кінці домен, необхідний длярозпізнавання і зв'язування дцРНК. Припускають, що розщеплення дцРНК уссавців здійснюється послідовно з одного кінця молекули. При цьомувідбувається АТР-залежна транслокація Dicer уздовжмолекули дцРНК. ВВнаслідок роботи Dicer утворюються дволанцюжкові siРНК довжиною 20-25 п.н.(Видоспецифічні ознака). Ці молекули містять гідроксильні групи наЗ'-кінцях і фосфатні на 5'-кінцях, а також по два виступаючих неспаренихнуклеотиду на З'-кінцях. Саме така структура необхідна для участі внаступних етапах процесу, що призводить до сайленсінгу РНК. Молекули з тупимикінцями або з модифікацією в 5'-кінцевий області активністю siРНК не володіють. Наступністадії інтерференції - розпізнавання і фрагментація РНК-мішені. siРНК зв'язується з групою білків,утворюючи багатокомпонентний нуклеопротеіновий комплекс RISC (RNA-induced silencing complex-комплекс, що здійснює індуковане РНКпридушення активності гена). До складу комплексу RISC входить білок сімейства Argonaute - Аgо2, що містить домени РАZ і PIWI. Данірентгеноструктурного аналізу свідчать про схожість просторовихструктур домену PIWI і РНКази Н.Очевидно, саме домен PIWIобумовлює ендонуклеазную активність всього комплексу. Припускають, щофункція РАZ полягає в розпізнаванні і зв'язуванніsiРНК, що мають два неспаренихнуклеотиду на З'-кінці. RISC,пов'язаний з дволанцюжкової siРНК,неактивний. Для його активації необхідно розбіжність ланцюгів siРНК, каталізуються АТР-залежноїХЕЛІКАЗОЙ. Показано,що активний RISC містить тільки антисмислової ланцюг siРНК, комплементарних ділянцімРНК-мішені, що дозволяє йому розпізнавати... і зв'язуватися зпослідовністю-мішенню на мРНК, комплементарної цього ланцюга. Після цьоговходить до складу комплексу RISCендорібонуклеаза розщеплює молекулу мРНК-мішені на фрагменти довжиною від 21 до23 н .. Урослин і черв'яків може відбуватися ампліфікація siРНК. За це відповідає РНК-залежна РНК-полімераза (RdRp). Використовуючи в якості затравкиантисмислової ланцюг siРНК, а вяк матриці - молекулу мРНК, цей фермент синтезує нові дцРНК, якіпотім перетворюються в siРНКза участю Dicer. У цих організмів інтерференції РНКмає системний ефект, як наслідок передачі сигналу з клітки в клітку абойого доставки у всі тканини організму. Таке явище називається системноюсупресією. Передача дцРНК або siРНКу рослин може відбуватися по цитоплазматичних містках з клітки в кліткуабо по системі судин. Таким чином механізмінтерференції РНК наступний: на першому етапі довга дцРНК нарізається білком Dicer з утворенням siРНК. Ця реакція протікає звикористанням енергії АТР. Далі дволанцюжкова siРНК зв'язується з групою білків, формуючи нуклеопротеїднікомплекс RISC (Етап 2). Один з його компонентів -АТР-залежна ХЕЛІКАЗОЙ, яка розкручує дуплекс siРНК. В результаті у складі RISC залишається тільки антисмислової ланцюг siРНК (Етап 3). Такий модифікованийкомплекс функціонально активний. Активоване RISC розпізнає і пов'язує мРНК-мішень за рахуноккомплементарного спаровування з нею антисмислової ланцюга siРНК (Етап 4). Далі входить до складу комплексу білок Аgо2 розрізає молекулу мРНК (Етап 5).У рослин і нематод існує механізм ампліфікації siРНК. При цьому РНК-залежна РНК-полімераза синтезує дцРНКна матриці мРНК, використовуючи в якості затравки антисмислової ланцюг siРНК (Додатковий етап).Новосинтезовані дцРНК розрізаються за участю Dicer, даючи початок новому пулу siРНК [5].
Рис. 6. Механізмінтерференції РНК I.5 Структура РНК-вміснихстресових гранул При деяких видахстресу наприклад, при тепловому шоці, впливі УФ-офлученія, енергетичномуголодуванні, окисному стресі в цитоплазмі клітин виникають стресовігранули - щільні РНП-містять цитоплазматичні тільця. У стресовігранули при стресі включається не вся клітинна мРНК: частина її продовжуєзберігати дифузне розподіл у цитоплазмі. Мабуть, для інкорпораціїмРНК в стресові гранули не потрібні які-небудь специфічні сигнальніпослідовності, оскільки репортерний мРНК, не несуча відомих сигнальнихпослідовностей, включається до складу стресових гранул. Швидше за все,специфічні сигнальні послідовності У складі стресовихгранул виявлені різні РНК-зв'язуючі білки, що зв'язують як більшістьцитоплазматичних мРНК, так і специфічні послідовності в певнихмРНК. До першої групи можна віднести РАВР (полі (А)-зв'язуючий білок), FMRP, основний білок мРНП Yв-1. Білок Staufen, що входить до складу транспортуються мРНП, входить ідо складу стресових гранул в Олігодендроціти, ймовірно, як В«неспецифічнийВ»РНК-зв'язуючий білок. До другої групи відносяться різні білки, специфічнозв'язують АU-багаті послідовності (АRE), що містяться в З'-кінцевій некодирующейобласті деяких, зазвичай короткоживучих, мРНК. З цієї групи білківлокалізація в стресових гранулах була показана для трістетрапроліна (ТТР),ендорібонуклеаза G3ВР, білків НuR, ВRF1, ТIА-1 іТIAR. Структурна основастресових гранул не вивчена, але дуже ймовірно, що вона складається зпріоноподобного конгломерату РНК-зв'язуючого білка ТIА-1, звичайно локалізованого в ядрі. Однією зперший адаптивних реакцій при стресових впливах на еукаріотичну кліткує зміна в системі трансляції. З одного боку, відбувається загальнепадіння рівня синтезу білка в клітині, а з іншого - активація трансляціїдеяких видів мРНК. Освіта стресових гранул відбувається одночасно ззагальним зниженням синтезу білка. На даний момент прийнято вважати, що самеінгібування синтезу білка на стадії ініціації трансляції викликає появустресових гранул в цитоплазмі. У разі окисного стресу, викликаногоарсенати, освіта стресових гранул залежить від інгібування ініціаціїтрансляції за рахунок фосфорилювання фактора еIF2. Фосфорилювання О±-субодиниці еIF2 по Sег-52 призводить до того, що еIF2 міцно зв'язується з фактором еIF2В і блокує заміну GDР на Gтр. Врезультаті в клітині відбувається різке зменшення кількості активної форми фактораеIF2-Gтр і, відповідно, зниження рівня потрійного комплексу(ЕIF2-тРНК Ме t -Gтр). У такій ситуації формуються неканонічні ініціаторниекомплекси, які не можуть перейти до елонгації трансляції. Який би не був механізм,запускає освіту стресових гранул, при стресорні впливівспочатку дифузне розподіл мРНП змінюється на локалізацію в окремихточках цитоплазми - стресових гранулах. Для подібного зміни локалізаціїнеобхідні значні переміщення індивідуальних мРНП. При цьому необхідновідзначити, що розмір мРНП досить великий і вільна дифузія частинокподібного розміру в цитоплазмі обмежена. Подолання обмеження дифузії вклітини відбувається за рахунок активного транспорту по цитоскелету - микротрубочкам абоАктинові філаменти. Руйнування актинових філаментів не інгібує утвореннястресових гранул, на відміну від порушення системи мікротрубочок. Викликанадією фармакологічних агентів деполімеризація мікротрубочок в клітціпригнічує утворення стресових гранул. Відновлення мікротрубочок на тліокисного стресу викликає виникнення в такій клітці стресових гранул.Швидше за все, роль мікротрубочок у формуванні стресових гранул полягає вактивному транспорті мРНП. Стресові гранули здатні переміщатися по клітці, іїх рух пригнічується при руйнуванні мікротрубочок. Компоненти стресовихгранул обмінюються з цитоплазмою, і цей обмін також значно сповільнюєтьсяпісля розбирання мікротрубочок. Таким чином, мікротрубочки необхідні дляпросторового переміщення компонентів стресових гранул(Полі (А)-зв'язуючого білка, фактора eIF2, білка TIA-1). Функціїстресових гранул поки залишаються незрозумілими. Можна припустити, що рольстресових гранул полягає в придушенні трансляції більшості матриць привиборчому відсутності придушення трансляції певних мРНК. Так, активнотранслюється при стресі мРНК шаперона Нsp70 не включається в стресові гранули. Синтез в клітинахрекомбінантної укороченою форми білка ТIА-1, інгібуючої освіту стресових гранул, одночаснопідсилює трансляцію репортерний мРНК в клітинах, підданих стресу.Стресові гранули можна представити як В«зал очікуванняВ», в якому В«пасажириВ»- Неповні ініціаторние комплекси - терпляче перечікують нельотну погоду. I.6 Поява концепції В«Миру РНКВ» Дійсно, РНКє унікальним біополімерів, якому властиві як функції ДНК, так ібілків. Її унікальні властивості бути як носієм наследуемой інформації, так іможливість утворювати складні тривимірні структури, що володіютькаталітичної активністю, визначають те, що первинною молекулою могла бутиРНК. Таким чином, в одній молекулі закладені як генотип, так і фенотип.Ключовим ферментом такого світу повинен бути фермент РНК-репликазу, зроблений зРНК. Спектр реакцій, виконуваних ферментами РНК - рібозімамі - дуже широкий,тому останнім часом ведуться дуже активні пошуки нових рибозимов,здатних здійснювати інші типи реакцій. I.6.1 рібозімов рібозімов - не зовсім ферменти: за своєю хімічною природою це не білки,а теж молекули РНК, тільки виконують спеціальні функції. Вони служатькаталізаторами при розщепленні і зшиванні інших молекул РНК. У рибозимов єцікава особливість: максимум їхньої активності припадає на низькітемператури. Тобто вони фактично забезпечують низькотемпературний каталіз. Перші рибозими, виявленіАльтманом і Чеком в 1982-1983 рр., були не особливо ефективні: вони лишерозрізали і з'єднували окремі фрагменти цілих молекул РНК. Однак подальшідослідження продемонстрували, що ці ферменти можуть каталізувати та іншіреакції. Джек Шостак, експериментуючи з модифікованими рібозімамі, зуміввиділити ка...талізатор, здатний з'єднувати один з одним короткі ланцюжкинуклеотидів. При цьому використовувалася енергія тріфосфатних хімічних груп -тих самих сполук, які і сьогодні забезпечують енергією біохімічніреакції. Ця обставина підтвердило ідею, що рибозими можутьфункціонувати подібним чином із сучасними білковими ферментами. У рядувидів примітивних еукаріот (Tetrahymena thermophila та ін) гени рРНК містятьособливі інтрони (інтрони групи 1), для яких характерний унікальний механізмсплайсингу. Такі інтрони зустрічаються також в генах рРНК мітохондрій, хлоропластів,дріжджів і грибів, однак вони не виявлені в генах хребетних тварин. Вивченняпроцесингу 26S рРНК тетрахімени (аналог 28S рРНК вищих еукаріотів), виконане Чеком і співробітниками,привело до відкриття особливого виду сплайсингу, здійснюваного без участінебудь білків і отримав назву аутосплайсінг (сплайсинг типу I). Виявилося,що міститься усередині 26S рРНКтетрахімени вставка (інтрон) довжиною 400 нуклеотидів здатна сама здійснювативирізування цього інтрони і зшивання екзонів у присутності Мg 2 + і вільного гуанозіна (або йогофосфорілірованний похідних). Таким чином була відкрита аутокаталітіческая функціяРНК і покладено початок вивченню рибозимов. Аутосплайсінгіндукується гуанозин,
Рис. 7. СамеНамВ Таким ВПізнішеЩоб Ця НайбільшТаким Висновок Таким Вернуться назад |