Розвиток генної інженерії

Міністерствосільського господарства

Російськоїфедерації

Федеральнедержавне освітня установа

Вищогопрофесійної освіти

В«АЛТАЙСЬКИЙДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ В»

Контрольнаробота

Студента

Заспеціальності

СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКАБІОТЕХНОЛОГІЯ

Виконав студент

Перевірив (а)

Барнаул2009

Питання № 1. Ферментигенетичної інженерії

Ферменти генетичноїінженерії - це ферменти, що дозволяють проводити різні маніпуляції змолекулами ДНК: розрізати в певних місцях, з'єднувати різні попоходженням фрагменти, синтезувати нові, не існуючі в природіпослідовності, і т.д. Розглянемо основні ферменти генетичної інженерії.

ДНК-полімерази. Одним з найбільш часто використовуванихв генетичній інженерії ферментів є ДНК-полімераза ДЄ, виділеназ E . coli або фага Т4. ДНК-полімераза ДЄволодіє здатністю подовжувати ланцюг ДНК в напрямку 5 в†’ 3шляхом приєднання комплементарного нуклеотиду. Ця властивість ДНК-полімеразвикористовується в генній інженерії для побудови другого комплементарної ланцюга: придодаванні ферменту до одноцепочной ДНК-матриці в присутності праймеравідбудеться її подвоєння. Ця властивість використовується, наприклад, при створенніКДНК-бібліотек. ДНК-полімераза застосовується також для заповнення В«проломиВ» в ланцюзіДНК, наприклад, при застраіваніі фрагментів з виступаючими 5 - кінцями.екзонуклеазная активність ДНК-полімераз використовується для введення радіоактивноїмітки у фрагмент ДНК.

Використанняспецифічних термостабільних ДНК-полімераз - Tth- і Taq - полимераз - виділених з бактерій, що живуть вгейзерах, дозволило проводити ампліфікації - множинну напрацюваннябудь-якого фрагмента ДНК методомполімеразной ланцюгової реакції (ПЛР). Метод ПЛР, воснову якого покладена Taq - полімераза,не тільки спростив деякі старі методики генної інженерії, але і дозволивпроводити молекулярне маркування як окремих генів, так і цілих геномів.

З деяких вірусів булавиділена специфічна ДНК-полімераза - РНК-залежна ДНК-полімераза, названаобратнгой транскриптазой, або ревертазой. ревертазой можуть синтезуватикомплементарну ланцюг ДНК на РНК-матриці. За допомогою ревертазой можна отримуватикДНК-ДНК-копії мРНК. кДНК дозволяють вивчати будову генів і ідентифікуватиповноцінні копії цих генів у геномі.

ДНК-лігаза здійснює одну функцію -з'єднання фрагментів ДНК шляхом відновлення фосфодіефірних зв'язків міжсполуками нуклеотидами. Цей процес називається лігування. Найбільш частодля лігування в генній інженерії використовують ДНК-лігази фага Т4. за допомогоюлігази Т4 з'єднують будь-які фрагменти ДНК з будь-якими кінцями: В«липкимиВ» абоВ«ТупимиВ». Це один з найбільш часто використовуються ферментів.

нуклеаз - це велика група ферментів,каталізують реакцію гідролізу молекул нуклеїнових кислот. В результатідії нуклеаз молекула ДНК або РНК розпадається на фрагменти чи окремінуклеотиди. Вихідна функція нуклеаз в клітці - деградація непотрібних в даний моментжиттєдіяльності молекул (наприклад, деградація мРНК після трансляції) і захиствід чужорідних молекул нуклеїнових кислот (розщеплення фагової ДНКбактеріальними нуклеазами при зараженні бактерії фагом).

нуклеаз за типом їхдії можна поділити на групи. Нуклеази можуть діяти тільки намолекули і ДНК, і РНК одночасно (Нуклеази золотистої квасолі). Нуклеазивибірково можуть діяти на одноцепочечную (Нуклеази S1), абодвуцепочечной (екзонуклеаза ДЄДЄДЄ) молекули ДНК, або нагібридну ДНК - РНК-молекулу (рибонуклеаза Н).

Крім того, Нуклеазиможна розділити на два типи: на екзонуклеази і ендонуклеази .Екзонуклеази зазвичай гідролізують молекули з 5 - або 3 - вільнихрешт, а ендонуклеази можуть розщеплювати всередині послідовності фрагмента абокільцевої молекули ДНК.

рестриктаз. Окрему групу, особливо зутилітарною точки зору її застосування в генній інжененріі, являютьспецифічні ендонуклеази - рестріктази.

В основі методу,дозволив безпосередньо приступити до маніпуляцій з генами, лежить відкриттяферментів, названих рестрикційних ендонуклеаз (рестріктазамі). Ще в1953р. було виявлено, що ДНК певного штаму E . Coli , введена в клітини іншого штаму (наприклад, ДНКштаму В в клітини штаму С), не проявляє, як правило, генетичноїактивності, так як швидко розщеплюється на фрагменти ДНК-специфічнимиферментами - рестріктазамі. До теперішнього часу з різних мікроорганізміввиділено більше тисячі різних рестриктаз. В генетичної інженерії найбільшшироко використовуються коло 200.

рестриктаз предщставляютсобою особливий клас ендонуклеаз, які гідролізують ДНК строго по певнихспецифічним послідовностям, називаються сайтами рестрикції. кожназ рестриктаз дізнається свій свій сайт рестрикції і розрізає ДНК або всерединіпослідовності сайту рестрикції, або в безпосередній близькості від нього.Таким чином, при дії конкретної рестріктази одна і та жпослідовність ДНК буде завжди утворювати однаковий набір фрагментів.Позначення рестриктаз складається з початкових літер латинської назви видубактерій, з якого був виділений фермент, і додаткового позначення, такяк з бактерій одного виду може бути виділено декілька різних рестриктаз: Eschrichia coli - EcoR I . EcoRV . Haemophilus influenzae - Hinf I.Streptomices albus - Sal I. Thermus aquaticus - Taq I.

рестриктаз діляться накілька типів за характером розщеплення нуклеотидної послідовності.Рестріктази ДЄ ТИПУ дізнатися сайтів рестрикції, але розщеплюєтьсяПОСЛІДОВНІСТЬ ДНК на довільній відстані (від нсколькіх десятків додекількох тисяч пар нуклеотидів) від сайту впізнавання. Такі рестріктазинеможливо використовувати для вирішення генно-інженерних задач. Рестріктази ДЄДЄДЄтипу схожі на рестріктази ДЄ типу, вони гідролізують ДНК на на рвсстояніі20 - 35 н.п. від сайтів впізнавання і також досить рідко використовуються впрактичних цілях.

Ферменти, що використовуютьсядля отримання рекомбінантних молекул, - рестріктази ДЄДЄ типу. Основнийхарактеристикою таких рестриктаз є те, що у них сайти впізнавання і місцярестрикції збігаються. Зазвичай рестріктаза ДЄДЄ типу дізнається певнупослідовність на ДНК і гідролізує її всередині послідовності сайтурестрикції. Сайти рестрикції рестриктаз ДЄДЄ типу представленісиметричними при поаороте на 180 градусів послідовностями - паліндромів:

5 GAATTC 3

3 CTTAAG 5 сайт рестрикції рестріктази EcoR ДЄ

5 TAGA 3

3 ATCT 5 сайт рестрикції рестріктази TaqДЄ

рестриктаз ДЄДЄтипу поділяються на кілька класів у залежності від раразмера сайту рестрикції ідовжини одержуваних фрагментів ДНК:

1)мелкощепящіе -сайт рестрикції яких представлений чотирма нуклеотидними парами;

2)среднещепящіе -сайт рестрикції - 6 - 8 н.п.;

3)крупнощепящіе -сайт рестрикції - 10 - 14 н.п.

рестриктаз ДЄДЄтипу можна віднести до двох груп по тому, як вони розщеплюютьпослідовність ДНК. Одні вносять розриви по осі симетрії впізнаваноюпослідовності, а інші - зі зрушенням, з утворенням В«сходинкиВ». У першомувипадку утворюються так звані В«тупіВ» кінці, а в другому - В«липкіВ», тобтофрагменти мають на своїх кінцях однонітевиє взаємно комплементарні ділянки.

Утворення прирозщепленні рестріктазамі фрагментів з В«липкимиВ» кінцями:

5 G ↓ AATTC5 Березня C ↓ CGG 3

EcoR Ī 3 CTTAA ↑ G 5 Hpa ĪĪ 3 GGC ↑ C 5

Утворення прирозщепленні рестріктазамі фрагментів з В«тупимиВ» кінцями:

TA ↓ GA 5 березня GTT ↓AAC 3

Taq ДЄ 3 AT ↑ CT 5 Hinc Д...Є 3 CAA ↑ TTG 5

Фрагменти ДНК, що маютьоднакові В«липкіВ» кінці, можуть з'єднуватися один з одним за допомогоюДНК-лігази, при цьому сайт рестрикції відновлюється. Фрагменти з В«липкимиВ»кінцями більш зручні для створення рекомбінантних ДНК, так як ДНК-лігазазабезпечує безперешкодне з'єднання фрагментів.

Ферментативна активністьрестриктаз вимірюється в одиницях активності. Це така кількістьферменту, який необхідно для повного гідролізу за 1:00 1 мкг ДНК фага О»при оптимальних умовах. оптимальні умови рестрикції для кожної рестріктазиє індивідуальними і залежать від рН, іонної сили, присутності певнихіонів, температури проведення реакції. Рестріктази є основнимиферментами, використовуваними в генетичній інженерії.

Питання № 2. Методиотримання химер

Успішна пересадкаембріонів може бути осуществленатолько між самками одного виду. Пересадкаембріонів, наприклад, вівцям і козам і навпаки супроводжується їхпріжівляемость, але не завершується народженням потомства. У всіх випадкахміжвидових вагітностей безпосередньою причиною абортів є порушенняфункції плаценти, мабуть, за рахунок імунологічної реакції материнськогоорганізму на чужорідні антигени плода. Ця несумісність може бутиподолана отриманням химерних ембріонів за допомогою мікрохірургії ..

Спочатку були отриманіхимерні тварини шляхом об'єднання бластомерів з ембріонів одного виду. Зцією метою отримували складні химерні ембріони овець об'єднанням 2 -, 4 -,8-клітинних ембріонів. Кожен складний об'єднаний ембріон складався з рівногочисла бластомерів ембріонів від 2 - 8 батьків. При цьому загальне число клітинколивалося від чотирьох-до восьмикратного збільшення нормального числа клітин.Ембріони вводили в агар і переносили в лігатірованние яйцепровід овець длярозвитку до стадії ранньої бластоцисти. Нормально розвиваються бластоцисти пересаджувалиреципієнтам і отримали живих ягнят, більшість з яких виявилися химернимиза даними аналізу крові і зовнішніми ознаками.

Отримані химерні вівцішляхом ін'єкції внутрішньої клітинної маси, виділеної іммунохірургіческім шляхомз ембріонів донорів в бластоцисти ембріонів реципієнтів. Зону пеллюціда убластоцист донорів видаляли инкубированием в 0,5%-ної пронази і пептірованіем.

Для відновлення їхфункції після обробки пронази ембріони культивували протягом 3 ч. Потімембріони без прозорої оболонки культивували протягом 1 год в антисироватки доклітинам печінки вівці, три рази відмивали і поміщали в розчин (1:4) сироваткикрові морської свинки на 1 ч. ціалізуватися клітини трофобласта видалялипіпетування, а ізольовану внутрішню клітинну масу вводили проколомін'єкційної піпетки через зону пеллюціда в трофобласт бластоцисти реципієнта.Після пересадки цих бластоцист отримані химерні ягнята як по рпізнакам групкрові, так і повнешнім ознаками.

Отримані химери і увеликої рогатої худоби (Г. Брем та ін, 1985) з'єднанням половинок 5 -6,5-денних ембріонів. П'ять із семи телят, отриманих після нехірургічноїпересадки агрегованих ембріонів, не мали ознак хімерізма. Один телябув химерою двох порід - бурою швіцкой і голштінофрізской. Однак масть буроюшвейцарської породи домінувала. Аналіз крові цього теляти показав присутністьгруп крові тільки від батьків голштінофрізской породи. Інший теля був химероюневизначеного походження.

Показана високаефективність отримання химер великої рогатої худоби об'єднанням морул беззони пеллюціда. Автори отримали химери великої рогатої худоби з В«подвійниймускулатурою В». У цих дослідженнях показано, що передача химерамбатьківського типу має випадковий характер, тобто потомство може розвиватисяз клітин, що відбуваються або від будь-якого ембріона, або від поєднання ембріонів.Половина всіх химер являє собою інтерес.

Найбільш показовоотримання химер від об'єднаних частин ембріонів різних видів, наприклад, вівці ікози.

Дослідження С.В. Фехілліта ін (1984) показали, що бластомери вівці і кози, укладені в агар іпоміщені на 4 - 5 добу в лігатірованний яйцепровід вівці, можуть формуватикомбіновані бластоцисти. Ці бластоцисти життєздатні і можуть розвиватисядо народження нормального потомства. У першому досліді в результаті об'єднання поодному бластомерів з 4-клітинних ембріонів вівці і кози отримано 17 бластоцист,пересадка яких завершилася здобуттям семи нащадків. Всі нащадки були схожів основному на ягнят, але у трьох з них руно мало поперечні валики і клаптіволосся, різко контрастують з щільно в'юнкою шерстю.

химери фермент нуклеаз

Питання № 3. Виписатиі дати пояснення термінам зустрівся при написанні контрольної роботи

Бактеріофаги(Фаги) -віруси, що інфікують бактерії.

Бібліотекагеному -набір клонованих фрагментів ДНК, що містить весь геном.

Пролом (пробіл) вДНК -відсутність одного або декількох нуклеотидів у ланцюгу ДНК.

гаплоїдії - ядро, клітина, організм,характеризуються одинарним набором хромосом, що становлять половину повногонабору, властивого даному виду організмів (символ n ).

Ген - одинична структура генетичноїінформації, ділянка хромосоми (молекули ДНК), що кодує структуру одного абодекількох поліпептидних ланцюгів, або молекул РНК, або певну регуляторнуфункцію.

Генна інженерія -сукупність прийомів, методів і технологій, у тому числі технологій отриманнярекомбінантних рибонуклеїнових і дезоксирибонуклеїнових кислот, по виділеннюгенів з організму, здійсненню маніпуляцій з ними і введенню їх в іншіорганізми.

диплоидов - ядро, клітина, організм,характеризуються подвійним набором гомологічних хромосом, представлених числом,характерним для даного виду (символ 2 n ).

ДНК - молекула дезоксирибонуклеїновоїкислоти, що складається з нуклеотидів (аденін, гуанін, цитозин, тимін),дезоксирибози і залишків фосфорної кислоти.

комплементарностіланцюг - одна з ланцюгів ДНК, використовувана вяк матриці для синтезу РНК і відповідна їй по взаємодії парнуклеотидів.

Лигирование - утворення фосфодіефірнимі зв'язкуміж двома підставами одного ланцюга ДНК, розділеним розривом. Цей термінвживають також у разі з'єднання тупих кінців і при утворенні зв'язку вРНК.

Липкий кінець - вільний одноланцюгових кінецьдвуцепочечной ДНК, комплементарної одноланцюгових кінця, що належить цій жеабо іншій молекулі ДНК.

Промотор - ділянка гена, відповідальний започаток його транскрипції.

РНК - молекула рибонуклеїнової кислоти,до складу якої входять нуклеотиди (аденін, гуанін, цитозин, урацил), рибоза ізалишки фосфорної кислоти.

Самка -реципієнт -самка в статеві шляхи якій вводяться яйцеклітини або ембріони для подальшоговиношування (синоніми: прийомна мати, ложнобеременная самка).

Хромосоми - генетичні структурніутворення ядра клітини, що складаються з ДНК і білків. У хромосомах укладенаспадкова інформація організму.

АТТ - Сайти - ділянки фагової і бактеріальноїхромосом, рекомбінація між якими призводить до інтеграції або виключеннюфага.

Сааті - ділянка консервативноїпослідовності, розташований приблизно на відстані 75 пар основ передстартовою точкою в транскрипційних одиницях еукаріот.

G -Білки - регуляторні білки, активуючіфермент, що синтезує вторинний посередник.

СПИСОКВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. В.С.Шевелуха, Е.А. Калашникова, Е.С. Веронін «ѲЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКА ...БІОТЕХНОЛОГІЯВ» -М.: Вища. Шк., 2003 рік.