Методи і умови культивування ізольованих клітин і тканин рослин

Автономне освітнєустанова

вищого професійногоосвіти

ЛенінградськийДержавний Університет

імені А.С. Пушкіна

Методи і умови культивування ізольованих клітин і тканинрослин

Санкт-Петербург

2009

Зміст

Введення

1.Вспомогательноевикористання методів in vitro в селекції рослин

2. Клітинна селекціярослин

3. Гібридизаціясоматичних клітин

Література

Введення

Один з напрямів клітинних технологій - це використання їх вселекції, яке полегшує і прискорює традиційний селекційний процес встворенні нових форм і сортів рослин. Існуючі методи культивуванняізольованих клітин і тканин in vitro умовно можна розділити на дві групи.

Перша група - це допоміжні технології, які не підміняютьзвичайну селекцію, а служать їй. До них можна віднести: запліднення in vitro (подолання програмноїнесумісності), культивування семяпочек і незрілих гібридних зародків(Подолання постгамной несумісності), отримання гаплоїдів шляхом культивуванняпиляків і мікроспор, кріозберігання ізольованих клітин, тканин і органів,клонального мікророзмноження віддалених гібридів.

Друга група методів веде до самостійного, незалежного відтрадиційних методів селекції, отримання нових форм і сортів рослин:клітинна селекція з використанням калюсних тканини, соматична гібридизація(Злиття ізольованих протопластів та отримання нестатевих гібридів), застосуванняметодів генної інженерії.

1. Допоміжне використання методів in vitro в селекції рослин

У віддаленій гібридизації знаходять застосування такі методи культуриізольованих тканин, як запліднення in vitro, ембріокультури(Вирощування ізольованих зародків на штучних поживних середовищах),клонального мікророзмноження цінних гібридів, а також отримання гаплоїдів in vitro і кріозберігання.

Запліднення in vitro (подолання прогамнойнесумісності) проводиться в тому випадку, коли неможливо здійснитизапліднення між обраними парами в природних умовах. Це викликанокількома причинами: 1) фізіологічні (невідповідність у часі достиганняпилку і т.д.); 2) морфологічні (коротка пилкова трубка або блокуваннязростання її на різних етапах розвитку і т.д.). Запліднення in vitro можна здійснити двомаспособами: а) культивування на штучної агаризованому живильному середовищізав'язі з нанесеною на неї готової пилком; б) зав'язь розкривається і наживильне середовище переносяться шматочки плаценти з насінними зачатками, поблизу якихабо безпосередньо на тканини плаценти культивується готова пилок. Візуальновизначити, пройшло запліднення in vitro чи ні, можна побистроувелічівающімся в розмірах семяпочкам. Сформувався зародок, якправило, не переходить у стан спокою, а відразу проростає і дає початокгібридному поколінню. Плацентарне запліднення in vitro дозволило подолатинесумісність в схрещуванні сортів культурного тютюну N. tabacum з дикими видами N. rosulata і N. debneyi і зробило можливимотримання міжвидових гібридів тютюну в дослідах М.Ф. Тернівського та ін(1976), Шинкарьова (1986).

Подолання постгамной несумісності . Постгамнаянесумісність при віддаленій гібридизації виникає після запліднення.Часто при цьому утворюються щуплі невсхожіе насіння. Причиною може бутирозбіжність у часі розвитку зародка і ендосперму. За слабкого розвиткуендосперму зародок буває нездатний до нормального проростання. У таких випадкахз зрілої щуплий зернівки ізолюють зародок і вирощують його в живильномусередовищі.

Вирощування зародків в штучному живильному середовищі називаєтьсяембріокультури. Середа для вирощування зрілого зародка може бути простою, бездобавок фізіологічекі активних речовин (наприклад, середу Уайта) або будь-якаінша, містить мінеральні солі і сахарозу. При більш віддаленихсхрещуваннях порушення в розвитку зародка можуть спостерігатися вже на ранніхетапах, що виражається у відсутності диференціювання, повільному зростанні. У цьомувипадку культура зародка складається з двох етапів - ембріонального ростузародка, під час якого триває його диференціювання, і проростанняпідрослого зародка. Для першого етапу потрібна більш складна за складом середуз підвищеним вмістом сахарози, з добавками різних амінокислот, вітамініві гормонів.

Застосування ембріокультури в селекції набуває останнім часомвелике значення для отримання віддалених гібридів зернових, злакових і іншихсільськогосподарських культур. Показана можливість збільшення виходу пшенично-житніхгібридів шляхом дорощування незрілих зародків, а також використанняембріокультури для подолання постгамной несумісності при гібридизаціїпшениці з колосняком.

Метод ембріокультури знаходить все більш широке застосування вміжвидової гібридизації овочевих рослин. Для цибулі розроблені прийоми вирощуванняin vitro абортивних зародків відгібридного насіння з різних етапів ембріогенезу, вирощування зародків від частковофертильних міжвидових гібридів. Культура ізольованих зародків використовується вселекції томатів та інших овочевих рослин.

Досліджено гормональна регуляція росту і розвитку зародківтомату in vitro. Обговорюється можливість застосування ембріокультури для отриманнявіддалених гібридів соняшнику, вивчаються чинники, контролюючі зростання ірозвиток in vitro зародків соняшнику, виділених в різні терміни післязапилення.

Культура ізольованих зародків як допоміжний метод привіддаленій гібридизації застосовується не тільки для подолання постгамнойнесумісності, але також з метою мікророзмноження цінних гібридів. У цьомувипадку мікророзмноження йде шляхом каллусогенеза, індукції морфогенезу іотримання рослин-регенерантів з калюсних тканини. Техніка клонуваннянезрілих зародків дозволяє розмножувати цінні генотипи рослин на ранніхстадіях життєвого циклу. Ще одна можливість застосування культури зародків-використанняїї в клітинній селекції.

клонального мікророзмноження віддалених гібридів. ембріокультури даєможливість виростити гібридні рослини з неповноцінних зародків. Однаквихід гібридних рослин малий, і гібриди часто бувають стерильні. Іноді,наприклад, при селекції гречки, важко відтворити в потомстві унікальнігенотипи через перехресного запилення культури. Тому перед дослідникамичасто постає завдання - розмножити і зберегти отримані рослини. У цьомудопомагає метод клонального мікророзмноження. Розмножують гібриди шляхом активаціїрозвитку меристеми пазушних бруньок (живцюванням стерильних пагонів),Адвентивна нирками або регенерацією рослин з калюсних тканини, зокремаотриманої при культивуванні зародків.

Отримання гаплоїдів in vitro і використання їх вселекції. Роль гаплоїдний рослин в селекції дуже велика. Застосування їх дозволяєшвидше знайти потрібну комбінацію, скорочує час для створення сорту. Гаплоідивикористовуються для отримання стабільних гомозиготних ліній. Для мутагенезу такожзручніше використовувати гаплоіди, оскільки на гаплоидном рівні полегшується відбіррецесивних мутацій.

У диплоїдних рослинах мутації рідко зачіпають обидва алельнихгена в гомологічних хромосомах. Особина зазвичай гетерозиготна (два генирозрізняються), при цьому проявляється дія тільки домінантного (але нерецесивного) гена. Оскільки мутації частіше рецесивні, ніж домінантні, їхдосить складно виявити. У гаплоїдний же рослинах, які містять тільки однуз кожної пари гомологічних хромосом, мутації виявляються негайно. Селекціяна гаплоидном рівні дозволяє вести прямий відбір не тільки домінантних, але ірецесивних ознак.

гаплоїдні особини стерильні, але можна штучно подвоїти набір їххромосом за допомогою колхіцину і отримати диплоїдні гомозиготні рослини.

гаплоїдії можуть виникати спонтанно, але ча...стота їх спонтанноговиникнення дуже мала. Штучним шляхом з Використанням методів in vitro вдається отримати великікількості гаплоїдних рослин. Існує три способи отримання гаплоїдів звикористанням методу культури ізольованих тканин:

андрогенез - отримання гаплоїдних рослин на штучному живильному середовищіз ізольованих пиляків і мікроспор.

гіногенез - отримання гаплоїдних рослин на штучному живильному середовищіз ізольованих семяпочек;

партеногенез - отримання гаплоїдів з гібридного зародка, у якого черезнесумісності хромосом батьків втрачені батьківські хромосоми.

Утворилися в результаті елімінації хромосом батьківського геному гаплоїдніембріоїдів культивують на штучних поживних середовищах і отримуютьгаплоїдні рослини. Сорти ячменю Джерело та Одеська-15 були отримані комбінацієюпартеногенетичного методу з культурою ізольованих зародків за чотири рокизамість звичайних 10-12 років. Методом культури пиляків з сортів та гібридівм'якої і твердої пшениці в НВО В«Еліта ПоволжяВ» за чотири роки отримано більше2,5 тис. дігаплоідних ліній, які характеризуються гомогенністю істабільністю.

Триває розробка технології одержання гаплоїдів допомогоюкультури пиляків пшениці, ячменю, кукурудзи, озимого жита, картоплі. У культуріпиляків можливі два шляхи освіти гаплоїдний рослин. Перший - освітурослин шляхом ембріогенезу в пилкових зернах. При цьому усередині пиляків зокремих пилкових зерен виникають ембріоїдів. Вони проростають і дають гаплоїднірослини. Другий - утворення калюсу з клітин пильовика. Надалі вВнаслідок морфогенезу з калюсних клітин регенерують рослини. У цьому випадкуутворилися рослини не завжди бувають гаплоїдний і часто відрізняються поплоїдності. До кінця не з'ясовано, утворюються вони від поліплоідізірованнихгаплоїдний клітин або від злилися клітин.

гаплоїдії, отримані in vitro, можуть застосовуватися нетільки в практичній селекції, але і в роботах по генетичній інженерії, атакож з клітинної селекції. Пилкові зерна є в деяких випадках більшзручними, ніж протопласти, об'єктами для дослідів по генетичної трансформації.

кріозберігання рослин. кріозберігання соматичних клітин рослин врідкому азоті (температура - 196 В° С) - новий напрямок в біотехнології,що широко стало розвиватися з початку 70-х років XX сторіччя. Мета даноїтехнології полягає в збереженні в культурі in vitro генофонду, а також взабезпеченні селекціонерів в будь-який час генотипом, мають шукані ознаки:необхідна пилок для проведення гібридизації; унікальні і одиничні насіння,в тому числі не виносять зневоднення; трансформовані, мутантні,гібридні клітини різних видів рослин, здатних до морфогенезу in vitro; зіготіческіе ісоматичні зародки і т.д. В даний час розроблені умовикріозберігання для культивованих клітин більше 30 видів, калюсних культур(Близько 10 видів), ізольованих протопластів (8 видів), збереження меристем (25видів) і кінчиків стебла (13 видів). Пріоритет у цьому напрямі належитьІнституту фізіології рослин РАН і, зокрема, відділу культури тканин іморфогенезу, очолюваному проф. Р.Г. Бутенко.

При проведенні робіт по кріозберігання необхідно, перш за все,враховувати специфіку рослинних клітин: відбирати дрібні клітини, з маленькоювакуолью і зниженим вмістом води; розробляти в кожному окремому випадкупідходи заморожування і подальшого відтавання рослинних клітин. Прикріозберігання зустрічається ряд труднощів, одна з яких пов'язана із захистомзаморожуваних клітин і тканин від осмотичного стресу і механічного руйнуванняструктур у результаті утворення і росту кристалів льоду всередині клітини.Одночасно з цим необхідно правильно підбирати умови, що забезпечуютьвисоку виживаність клітин при відтаванні і рекультивації.

Незважаючи на різноманіття робіт у цьому напрямку, в них все жнамітилися загальні прийоми, що лежать в основі кріозберігання: обробка клітинперед заморожуванням, застосування кріопротекторів, дотримання певногорежиму заморожування в інтервалі від 0 до -40 В° С (в окремих випадках до -70 В° С), атакож спеціальні заходи при відтаванні об'єктів.

Процес кріоконсервації, як правило, починається з підготовкикультури клітин до заморожування. Це може бути досягнуто кількома способами,передбачають культивування клітин на поживних середовищах, що містятьрізні осмотично активні речовини: маніт або сорбіт в концентрації 2-6%,амінокислоти і серед них, в першу чергу, пролін, чиє значення для зв'язуванняводи в клітинах рослин широко відомо, а також у-аміномасляна кислота.

Підбір кріопротекторів, речовин, що зменшують пошкодження клітин відосмотичного та механічного стресу, проводять емпірично за принципомнайменшої токсичності та оптимального ефекту. Серед усіх відомихкріопротекторів виділяються такі легко проникають в клітини речовини, якдиметилсульфоксид (ДМСО, 5-10%), гліцерин (10-20%), а також непроникаючівисокомолекулярні-полівінілпіролідон (ПВП), декстран, поліетиленгліколь (ПЕГ)з молекулярною масою 6000.

Велике значення при кріозберігання має правильно підібранийрежим заморожування від 0 до -40 В° С. Як правило, для всіх об'єктіввстановлюється швидкість заморожування 0,5-1 В° С в хвилину і всю цю роботупроводять на спеціальному обладнанні, що забезпечує програмне заморожування.Такі прилади випускає спеціальне конструкторське технологічне бюро здослідним виробництвом при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини (м. Харків).

Таким чином, повільне заморожування і використаннякріопротекторів дозволяє звільнити клітку від вільної води, і при -40 В° Склітини стають повністю зневоднений, що дає можливість проводитиподальше заморожування, а саме занурювати ампули з рослинним матеріалом урідкий азот.

Зберігання матеріалу в рідкому азоті практично не лімітовано.Наприклад, в кріобанку Інституту фізіології рослин РАН зберігаються клітини моркви,які знаходяться в рідкому азоті близько 20 років, меристеми картоплі - більше 10років та ін

Відтавання і перевірка життєздатності клітин після зберігання врідкому азоті є останнім етапом технології кріозберігання. Якщозаморожування здійснюють повільно, поступово, то відтавання повинно бутипроведено якнайшвидше. Для цього ампули поміщають у водяну баню зтемпературою 40 В°, а іноді і 60 В° С і витримують до повного зникнення останньогокришталика льоду.

Для визначення життєздатності клітин після відтавання застосовуютьнайбільш простий, швидкий і цілком задовільний спосіб - забарвленнявітальним барвником (0,1%-ним феносафраніном або 0,25%-ним розчином синіЕванса), в результаті якої мертві клітини фарбуються, а живі немає. Остаточнимкритерієм, безумовно, служить чітке відновлення зростання і ділення клітин прирекультивації на штучних поживних середовищах після відтавання.

Експериментально було показано, що клітини після зберігання в рідкомуазоті не втрачають здатності до поділу, регенерації рослин, не зменшуєтьсяпродуктивність синтезу вторинних метаболітів (клітини продуценти) і т.д. Так,Інститутом фізіології рослин РАН спільно з НУО з картоплярстварозроблені методи кріозберігання меристем чотирьох сортів картоплі та показанаможливість з 20% зберігаються меристем регенерувати цілі рослини, якіпри висадці в полі не відрізнялися за всіма ознаками, включаючи темпи зростання іпродуктивність, від звичайних пробіркових рослин (С. Манжулін та ін, 1982).Більш докладно про техніку кріозберігання можна дізнатися з оглядових робіт О.С. Попова.

Таким чином, технологія, пов'язана з кріозберіганнярослинних об'єктів, розвивається і постійно удосконалюється. Безсумнівно,ця технологія має своє майбутнє, так як вже сьогодні кріобанк можутьзначно полегшити роботу селекціонерів, надавши їм можливість широковикористовувати пул генів сортів, в тому числі старої селекції і диких видів, атакож зникаючих видів рослин.

2. Клітинна селекція рослин

сомаклональної варіабельність . Метод культури ізольованих клітин,тканин і органів рослин in vitro, широко використовуваний для вир...ішення багатьохфундаментальних питань клітинної біології, фізіології та генетики рослин, вданий час знаходить все більше застосування і при створенні новихбіотехнологій. Починаючи з перших робіт з культивування рослинних клітин,тканин і органів особливий інтерес у дослідників викликало питання про те, якіклітинні зміни можуть відбуватися в ізольованих клітинах, що ростуть наштучних поживних середовищах, і причини, що їх викликають. З розробкоютехніки отримання рослин-регенерантів з калюсних тканини з'явиласяможливість отримувати нові форми рослин, що відрізняються як по фенотипічних,так і за генетичними ознаками від вихідних рослин. Така різноманітність середклітинних ліній та рослин-регенерантів отримало назву В«сомаклониВ», хоча щев 70-80-і роки нашого століття було прийнято називати рослини, регенеруватиз калюсних тканини, В«калліклонаміВ», а з протопластів - В«протоклонаміВ».

Генетична природа і механізм виникнення сомаклональноїклітин.змінами.Однакхромосом.ДляОднаккрохмалю.Длядослідження.

Однак приЯкТак якПрямафакторам.

Вжеамінокислот. Щоом, використання калюсних культури вселекційних цілях відкриває величезні можливості у створенні нових формрослин, що несуть цінні ознаки, необхідні для людства.

Поряд з перерахованими вище об'єктами (калюсних, суспензійнакультура, ізольовані протопласти), в якості вихідного матеріалу дляселекції можуть бути використані культури соматичних або андрогеннихембріоїдів, такі органогенні експланти, як сегменти листя або різнімеристематичних і стеблові частини рослин, а також культура ізольованихзародків. Наприклад, шляхом культивування і селекції in vitro зародків з насінняотримані рослини ячменя, стійкі до аналогів амінокислот, з поліпшенимвмістом білка. Для картоплі розроблено ефективний метод обробки пагоніві живців мутагеном, що приводив до отримання химерних мутантівхлорофіллдефектності і антибіотикостійкість. При культивуванні пиляківярої пшениці сорту Саратовська-29 і Москов-ська-35 на поживних середовищах зпідвищеним вмістом солей хлориду натрію отримані соматичні ембріоїдів, анадалі рослини-регенеранти, що проявили підвищену солестійкість(Беккужіна, 1993).

Таким чином, проведення селекції на клітинному рівні дозволяєстворювати нові форми рослин в 2-4 рази швидше в порівнянні з традиційнимиспособами селекції.

3. Гібридизація соматичних клітин

Наступний метод клітинної селекції-створення нестатевих гібридівшляхом злиття ізольованих протопластів, отриманих із соматичних клітин.Цей метод дозволяє схрещувати філогенетично віддалені види рослин,які неможливо схрестити звичайним статевим шляхом, викликати злиття трьох ібільше батьківських клітин, отримувати асиметричні гібриди, які несуть весь геннийнабір одного із батьків поряд з кількома хромосомами або генами, аботільки органелами і цитоплазмою іншого. Гібридизація соматичних клітин даєможливість не тільки з'єднати в одному ядрі гени далеких видів рослин, але іпоєднувати в гібридній клітині цитоплазматичні гени партнерів.

Виділення, культивування і злиття ізольованих протопластів. Для застосування методівсоматичної гібридизації необхідна розробка відповідних технологійотримання протопластів, здатних ділитися і регенерувати рослини. Виділенняпротопластів рослинних клітин шляхом їх плазмолізірованія і механічногоруйнування клітинної стінки було здійснено ще в кінці минулого століття. Однакметод ізольованих протопластів отримав розвиток лише після того, як в 1960 р.І.К. Коккінг вперше здійснив ферментативне руйнування клітинної стінкиі виділив голі протопласти.

В даний час продовжується розробка та вдосконаленняметодів виділення і культивування протопластів на штучних поживнихсередовищах (рис. 1.15). Для культивування протопластів застосовують ті жпоживні середовища, що і для культури ізольованих клітин і тканин.Відмінною рисою середовищ для протопластів є підвищений осмотичнийтиск на початкових етапах культивування, яке забезпечується високоюконцентрацією маніту або СаС1 2 .

У процесі культивування ізольовані протопласти регенеруютьнову клітинну стінку і перетворюються на клітини, здатні ділитися і даватипочаток утворенню калюсних тканини. На формування колоній протопластіввпливає склад живильного середовища. Подальше завдання - отримання з калюснихтканини рослин-реге-нерантов. Поки не вдалося отримати регенеранти зпротопластів багатьох злакових (пшениці, ячменю). Однак успішно здійснюєтьсярегенерація з протопластів пасльонових (тютюн, картопля, томати) і іншихкультур.

Протопласти виділяють з калюсних, суспензійних клітин або зклітин листя, меристем, стебел. При виділенні протопластів з листяспочатку видаляють епідерміс, лист нарізають на сегменти і потім піддаютьензиматичного обробці пектиназу і целюлозою (Додаток 2).

Злиття ізольованих протопластів може відбуватися спонтанно, аледосить рідко. Індуковане злиття ізольованих протопластів вперше булоотримано в лабораторії Коккінг в 1970 р. його співробітниками Пауером та ін Уяк індуктора вони використовували нітрат натрію. Але цей метод виявивсямалоефективним, і зараз знайдені інші фьюзогени (індуктори злиття).Найбільш ефективними з них виявилися розчини з високим рН (9-11) і високоїконцентрацією іонів кальцію (100-300 мМ). Протопласти попередньоагглютинируют за допомогою концентрованих розчинів поліетиленгліколю змолекулярною масою 1500-6000. У. Циммерман зі співробітниками. розробилифізичний метод злиття протопластів клітин тварин, ліпосом, в якому вяк індуктора використовувалися імпульси електричного струму.

Злиття протопластів призводить до утворення або гібрида, абоцибріди (рис. 1.17). Цибридних клітина містить цитоплазму обох партнерів,а ядро ​​- одного. Це можливо в тому випадку, якщо після злиття протопластів НЕвідбувається з'єднання ядер, і одне ядро ​​дегенерує. Освіта цибрідиможливо і в тому випадку, якщо один з протопластів позбавлений ядра або воноінактивовані шляхом опромінення.

Цібрідізація дозволяє ввести цитоплазматичні гени, що несутьознаки ЦМС (цитоплазматичної чоловічої стерильності), стійкості додеяким гербіцидів і патогенів.

Перший нестатевий міжвидовий гібрид вищих рослин отриманий в 1972 р.шляхом злиття ізольованих протопластів двох видів тютюну: Nicotiana glauca і N. Langsdorfii.

В даний час методом парасексуальними гібридизації отримановелике число міжвидових, межсемейственних і межтрібних гібридів. Однак підбагатьох випадках гібридні рослини, отримані таким шляхом, в тій чи іншійступеня ненормальні. Прикладом може служити соматичний гібрид міжарабідопсис і турнепсом, який є рослиною-монстром. Виникаючіаномалії є результатом хромосомної незбалансованості (Ю.Ю. Глєба,1982).

Особливий інтерес представляють межцарственние клітинні гібриди,отримані від злиття протопластів рослинних і тваринних клітин. Описаногібриди між протопластів еритроцитів щура і протопластів дріжджових клітин,між протопластів моркви і людини, тютюну і людини та ін

При соматичної гібридизації експеримент будується аналогічнодослідам по генетиці мікроорганізмів. Іншими словами, використовуються великіпопуляції клітин обох батьків. При обробці змішаної суспензіїпротопластів фьюзогенамі частина з них зливається один з одним, але в суспензіїзалишаються і несли протопласти. Всі вони, включаючи гібридні, вдальнейшемрегенерують клітинні стінки і переходять до розподілам. Виникає задача - виділитиіз загальної маси гібридні екземпляри. Селекція гібридів може застосовуватися абона клітинному рівні, або на стадії регенерації і здійснюється декількома методами.

Для ідентифікації гібридів можуть служити пластиди. Наприклад, призлитті протопластів тютюну та моркви в якості селективних маркеріввикористовувалися зелені хлоропласти тютюну і червоно-оранжеві хромопласти моркви.

Іншим методом, що дозволяє проводити відбір гібридів, єгенетична комплементації. Цей метод був застосований для виявлення гібридівтютюну, при цьому використовув...алися хлорофіллдефектние мутації у батьків з подальшоюкомплементації в гібридних продуктах. Поєднання двох ядерних рецесивнихмутацій у тютюну викликає светоза-висимо хлорофілльную недостатність.Рослини, гомозиготні по будь-якому з цих генів, вирощувані при інтенсивномуосвітленні, знебарвлюються і гинуть. Після злиття і регенерації клітинніколонії пересаджують на середу, індукує стеблової органогенез, і культивуютьна світлі.

Під методом фізіологічної комплементації, який такожвикористовується для виявлення соматичних гібридів, мають на увазі здатністьгібридних клітин жити і розмножуватися або переходити до морфогенезу в умовахкультури, при яких батьківські клітини цього робити не в змозі, причомунездатність батьківських клітин не пов'язана з якою-небудь певноюмутацією, а є нормальною фізіологічною реакцією клітини нафізіологічні умови. Наприклад, статеві гібриди між N. glauca і N. Langsdorfii мають схильність до пухлиноутворення,а клітини гібридів в умовах in vitro здатні рости і розмножуватися на живильнихсередовищах без гормонів. Гормононезалежну клітин гібрида і була покладена воснову методу селекції. Після індукованого злиття протопластів з мезофіллалистя обох видів тютюну клітини через деякий час пересаджували наживильне середовище, що не містить фітогормонів, і відбирали колонії, здатнірости в цих умовах. Існують також інші методи селекції соматичнихгібридів: змішана фізіологогенетіческая комплементації, фізичне збагачення(Метод заснований на поділі протопластів при центрифугуванні у зв'язку з їхрізною щільністю), механічна ізоляція.

Використання ізольованих протопластів в селекції рослин необмежується можливістю їх індукованого злиття і отримання соматичнихгібридів. Ізольовані протопласти здатні поглинати з навколишнього середовищамакромолекули і органели, отже, в них можна вводити чужоріднуінформацію, не пересаджуючи ДНК або органели інших клітин. Вже проведенауспішна трансплантація ізольованих ядер в протопласти петунії і тютюну.Разом з тим поглинання протопластів чужорідних ядер не завжди веде доутворення гібридів. Крім ядер в ізольовані протопласти вдалосятрансплантувати чужорідні хлоропласти. З цих протопластів Карлсон отримаврослини-регенеранти, що містять хлоропласти іншого організму.

Однак роботи по перенесенню чужорідних органел і ДНК тількипочинають розвиватися. У цілому використання ізольованих протопластів угенетичної реконструкції клітини, як ми бачимо, відкриває багаті перспективиперед клітинної селекцією.

Література

1.Бутенко Р.Г. Культураклітин рослин і біотехнологія. - М.: Наука, 1986.

2.Катаєва Н.В.,Бутенко Р.Г. клонального мікророзмноження рослин - М Наука, 1983.

3.ШевелухаB.C. Ріст рослин і йогорегуляція в онтогенезі. - М.: Колос, 1992.

4.Шевелуха В.С.,Калашникова С.В., Дегтярьов С.В. та ін Сільськогосподарськабіотехнологія - М.: Вища школа, 1998.