Методи дослідження клітин

План

Вступ

Розділ I Мікроскопічні дослідження як метод пізнанняклітини

1.1 Світлова мікроскопія та її можливості

1.1.1 Звичайна оптична мікроскопія

1.1.2Флуоресцентная мікроскопія

1.1.3 Фазово-контрастна і інтерференційна мікроскопія

1.2 Електронна мікроскопія

1.3 Рентгеноскопія

Розділ II Методи вивчення хімічного середовища живих клітин

2.1 Використання ядерного магнітного резонансу (ЯМР) для визначенняхімічних умов в живих клітинах

2.2 Використання внутрішньоклітинних електродів

2.3 Використання світловипромінювальних індикаторів

Розділ III Методи культивування клітин і визначення їхскладу

3.1 Методи культивування клітин

3.2 Фракціонування клітинного вмісту

Розділ IV. Технологія рекомбінантних ДНК

4.1 Виділення та фракціонування ДНК

4.2 Розщеплення ДНК рестріцірующімі нуклеазами

4.3 Секвенування ДНК

Висновок

Список використаної літератури

Вступ

Клітки дуже малі врозміром і складно влаштовані: важко розглянути їх структуру, важко визначитимолекулярний склад і ще важче встановити, як функціонують їх окреміелементи. Для вивчення клітин розроблено безліч експериментальних методів,можливості яких визначають рівень наших знань у цій області. Успіхи ввивченні біології клітини, включаючи найбільш дивовижні досягнення останніхроків, як правило, пов'язані з застосуванням нових методичних підходів. Томудля розуміння клітинної біології необхідно мати деяке уявлення провідповідних експериментальних методах.

Метою нашої роботи ми поставиморозгляд сучасних методів, використовуваних для вивчення клітин. Мирозглянемо сучасні методи, використовувані для вивчення клітин. Ми почнемознайомитися з тими з них, які дозволяють вивчати клітину як єдине ціле, іпотім звернемося до аналізу складових клітку макромолекул. Відправною точкоюстане мікроскопія, оскільки клітинна біологія почалася зі світловоюмікроскопії, і цей метод досі залишається вельми ефективним інструментомдослідження, поряд з більш сучасними пристроями для отриманнязображення, заснованими на електронних пучках чи інших формах випромінювання. Відпасивного спостереження ми поступово перейдемо до методів, що припускають активневтручання: розглянемо, як клітини різних типів можуть бути відокремлені відтканини і при цьому зберігати здатність рости, дізнаємося, як клітини можназруйнувати, а клітинні органели і складові їх макромолекули виділити вчистому вигляді. І, нарешті, ми викладемо суть технології рекомбінантних ДНК,завдяки якій стало можливим виділяти, секвенувати і маніпулюватигенами і, отже, вивчати механізми їх дії в клітці. Також мисистематизуємо їх, виділимо основні віхи, які вдалося досягти завдякиїх застосуванню.

Розділ I . Мікроскопічні дослідження якметод пізнання клітини

Діаметр типовою клітинитварин становить 10-20 мкм, що в п'ять разів менше найдрібнішої видимоїчастинки. Тільки з появою досконалих світлових мікроскопів на початку XIX століттявдалося встановити той факт, що всі тканини тварин і рослин складаються зокремих клітин. Це відкриття, узагальнене в формі клітинної теорії Шлейденом іШванном в 1838 році, знаменує собою початок клітинної біології.

Будучи надзвичайно малимиза розмірами, тваринні клітини до того ж безбарвні і прозорі: отже,відкриття їх основних структур стало можливим завдяки розробці наборубарвників в кінці XIX століття. Саме барвники забезпечили достатнійконтраст для спостереження субклітинних структур. Схожа ситуація спостерігалася впочатку 40-х років нашого століття, коли винахід потужного електронногомікроскопа зажадало нових методів збереження і забарвлення клітин. І тількипісля того, як вони були розроблені, почала проявлятися вся складністьклітинної структури. В основі мікроскопії як методології досі лежатьспособи приготування зразка і можливості самого мікроскопа.

1.1 Світлова мікроскопіяі її можливості

1.1.1 Звичайнаоптична мікроскопія

У загальному випадку випромінювання даної довжинихвилі може бути використано для вивчення тільки таких структур, мінімальнірозміри яких ще можна порівняти з довжиною хвилі самого випромінювання. Цей принципобмежує можливості будь-якого мікроскопа. Межа дозволу світловогомікроскопа задається довжиною світлової хвилі, яка для видимого світла лежить в межахвід 0,4 мкм (фіолетовий) до 0,7 мкм (темно-червоний). З цього випливає, щосамими маленькими об'єктами, які ще можна спостерігати у світловий мікроскоп,є бактерії і мітохондрії (їх ширина ~ 0,5 мкм). Більш дрібні елементиклітини спотворюються ефектами, викликаними хвильовою природою світла.

Для приготуванняпостійного препарату, який можна забарвити і спостерігати в мікроскоп, клітиниобробляють фіксуючим агентом з тим, щоб иммобилизировать, вбити ізберегти їх. У сучасних методах, як правило, використовується обробкаальдегідами, наприклад, формальдегідом або глутаральдегідом, які формуютьковалентні зв'язки з вільними аміногрупами білків і, таким чином, зшивають сусіднімолекули.

Після фіксації тканинизазвичай ріжуть на дуже тонкі "скибочки" (зрізи) на мікротоми. Зрізитовщиною від 1 до 10 мкм поміщають на поверхню предметного скла. В якостіукладають середовищ використовують парафін або спеціальну смолу. У рідкому вигляді ці середовищапросочують і оточують фіксовану тканину: потім вони тверднуть приохолодженні або за рахунок полімеризації, утворюючи твердий блок, який зручнорізати на мікротоми.

Існує серйознанебезпека того, що процедури фіксації або укладення можуть пошкодити структуруклітин або клітинних макромолекул. Ось чому запропонований інший методприготування зрізів - швидке заморожування. Заморожену тканину ріжуть накриостате в спеціальному мікротоми, встановленому в холодній камері.

У вмісті більшостіклітин, що складаються, як правило, на 70% з води, практично відсутнікомпоненти, здатні перешкодити проходженню світлових променів. Тому вприродному стані більшість клітин навіть після фіксації і приготуваннязрізів практично невидимі у звичайному світловому мікроскопі. Одна з можливостейїх побачити полягає в забарвленні клітин барвниками.

1.1.2Флуоресцентнаямікроскопія

Оскільки більшістьмакромолекул представлені в клітинах відносно незначним числом копій,одна або дві молекули барвника, пов'язані з макромолекулою, можуть залишатисянепоміченими. Альтернативний підхід до проблеми чутливості полягає ввикористанні флуоресценції.

Флуоресціюючі барвникипоглинають світло однієї довжини хвилі і випромінюють світло іншої довжини хвилі, більшдовгою. Якщо таку речовину опромінити світлом, довжина хвилі якого збігається здовжиною хвилі світла, що поглинається барвником, і потім для аналізу використатифільтр, що пропускає світло з довжиною хвилі, відповідної світла, випромінюваногобарвником, флуоресціюють молекулу можна виявити за світінням на темному полі.Висока інтенсивність випромінюваного світла є характерною особливістю такихмолекул.

Застосуванняфлуоресціюючих барвників для фарбування клітин припускає використанняспеціального флуоресцентного мікроскопа. Такий мікроскоп схожий на звичайнийсвітловий мікроскоп, але тут світло від освітлювача, випромінюваний потужним джерелом,проходить через два набори фільтрів - один для затримання світла перед зразком іінший для фільтрації світла, отриманого від зразка.

Флуоресцентнамікроскопія часто використовується для виявлення специфічних білків або іншихмолекул, які стають флуоресціюючими після ковалентного зв'язування зфлуоресціюючими барвниками. Наприклад, флуоресціюючі барвники можуть бутипов'язані з молекулами антитіл, що відразу ж перетворює їх на високоспецифічніі зручні фарбувальні реагенти, селективно зв'язуються зі специфічнимимакромолекулами на пов...ерхні живий або всередині фіксованої клітини. Для цієїмети зазвичай використовують два барвника - флуоресцеїну, який даєінтенсивну жовто-зелену флуоресценцію після порушення світло-блакитнимсвітлом, і родамін, обумовлює темно-червону флуоресценцію після порушенняжовто-зеленим світлом.

1.1.3Фазово-контрастна і інтерференційна мікроскопія

Можливість втрати абопорушення зразків в процесі їх приготування завжди турбуваламікроськопістов. Єдиний спосіб вирішити цю проблему полягає у вивченніживих клітин без фіксації або заморожування. Для цієї мети дуже кориснімікроскопи зі спеціальними оптичними системами.

При проходженні світлачерез живу клітину фаза світлової хвилі міняється згідно з коефіцієнтом рефракціїклітини: світло, що проходить через відносно тонкі або відносно товстіділянки клітини, такі, як ядро, затримується, і його фаза відповіднозсувається по відношенню до фази світла, що проходить через відносно тонкі ділянкицитоплазми. Як у фазово-контрастному, так і в інтерференційної мікроскопії використовуютьсяефекти інтерференції, що виникають при рекомбінації двох наборів хвиль, якіі створюють зображення клітинних структур. Обидва типи світлової мікроскопії широковикористовуються для спостереження живих клітин.

Найпростіший спосіброзгледіти деталі клітинної структури - спостерігати світло, розсіюютьсярізними компонентами клітини. У темнопольному мікроскопі промені відосвітлювача направляються збоку і при цьому в лінзи мікроскопа попадають тількирозсіяні промені. Відповідно клітка виглядає як освітлений об'єкт на темномуполе. Однією з основних переваг фазово-контрастної, інтерференційної ітемнопольній мікроскопії є можливість спостерігати рух клітин упроцесі мітозу і міграції

Відеокамери та відповіднітехнології обробки зображення значно збільшили можливості світловиймікроскопії. Це дозволило спостерігати клітини протягом тривалого часу принизької освітленості, виключаючи тривалий вплив яскравого світла (або тепла).Оскільки зображення створюється відеокамерою у формі електронних сигналів, йогоможна відповідним чином перетворити в числові сигнали, направити вкомп'ютер і потім піддати додатковій обробці для вилучення прихованоїінформації. Ці та подібні методи обробки зображення дозволяютькомпенсувати оптичні недоліки мікроскопів і практично досягти межідозволу.

Високий контраст,досяжний за допомогою комп'ютерної інтерференційної мікроскопії, дозволяє спостерігати навіть дуже дрібні об'єкти, як, наприклад, окремі мікротрубочки діаметряких менше однієї десятої довжини хвилі світла (0,025 мкм). Окремімікротрубочки можна побачити і за допомогою флуоресцентної мікроскопії. Однак вобох випадках неминучі ефекти дифракції, сильно змінюють зображення.Діаметр мікротрубочок при цьому завищується (0,2 мкм), що не дозволяє відрізнятиокремі мікротрубочки від пучка з декількох мікротрубочок.

1.2 Електроннамікроскопія

Взаємозв'язок довжини хвилісвітла і межі дозволу зберігається для будь-якої форми випромінювання, як длясвітлових променів, так і для електронів. Однак в останньому випадку межадозволу істотно нижче. Довжина хвилі електрона зменшується зі збільшеннямйого швидкості. В електронному мікроскопі з напругою 100000 В довжина хвиліелектрона дорівнює 0.004 нм, а згідно теорії, дозвіл такого мікроскопастановить 0,002 нм.

Загальна схемапросвітчастого електронного мікроскопа (ПЕМ) нагадує схему світлового, хочаелектронний мікроскоп значно більше і як би перевернуть. Джереловипромінювання - нитка катода, що випускає електрони з вершини циліндричної колонивисотою близько двох метрів. Оскільки при зіткненні з молекулами повітряелектрони розсіюються, у колоні повинен бути створений вакуум. Електрони,випромінювані катодного ниткою, прискорюються найближчим анодом і проникають черезкрихітний отвір, формуючи електронний промінь, що проходить у нижню частину колони.Уздовж колони на деякій відстані розташовані кільцеві магніти,фокусують електронний промінь, подібно скляним лінзам, фокусирующим промінь світлав світловому мікроскопі. Зразок через повітряний шлюз поміщають у вакуум колони,на шляху електронного пучка. Частина електронів у момент проходження через зразокрозсіюється згідно щільності речовини в даній ділянці, залишок електронівфокусується й утворить зображення на фотопластинці або на фосфоресціюючіекрані.

В електронному мікроскопіне можна спостерігати живі об'єкти. Тому тканини фіксують, зшиваючи клітини іклітинні структури глутаральдегідом, а потім обробляють осмієва кислота.Зразки зневоднюють, фіксують смолами і нарізають тонким скляним абоалмазним ножем.

Тонкі зрізи практичноє двовимірними зрізами тканини і не дозволяють судити про тривимірну структуруклітинних компонентів. Тривимірне зображення можна отримати післяреконструкції сотень серійних зрізів. В даний час розроблені більш пряміметоди отримання тривимірного зображення. Один з них полягає у вивченнізразка під скануючим електронним мікроскопом. Для отримання зображення впросвечивающем електронному мікроскопі використовують електрони, що проходять череззразок, а в скануючому електронному мікроскопі використовуються електрони,розсіюється або випромінювані поверхнею зразка. У даному випадку зразокповинен бути зафіксований, висушений і покритий тонкою плівкою важкого металу.Потім зразок сканується дуже вузьким пучком електронів. Таким чиномвідбувається формування єдиного, цілісного і значно збільшеногозображення.

Метод скануючоїелектронної мікроскопії забезпечує значну глибину фокусування; більштого, оскільки масштаби розсіювання електронів визначаються кутом поверхніпо відношенню до променя, на зображенні виникають чергуються світлі й темніділянки, що створюють враження тривимірності. Але цей метод застосуємо тільки длявивчення поверхні і його дозвіл порівняно невелика (близько 10 нм зефективним збільшенням приблизно 20 тис. раз). Даний метод практичнонепридатний для вивчення субклітинних органел і використовується виключно длявивчення цілих кліток і тканин.

Просвічуючийелектронний мікроскоп можна використовувати для вивчення поверхні зразка здуже великим збільшенням, спостерігаючи окремі макромолекули. Як і прискануючої електронної мікроскопії, на висушений зразок напилюється тонкаплівка важкого металу. Метал напилюється під певним кутом, так щовідкладення напилення плівки в деяких місцях товстіше, ніж у інших. Цейпроцес відомий як відтінення - тут виникає ефект тіні, що створюєвраження тривимірності зображення.

Приготовлені такимчином зразки можуть бути досить малі і тонкі, щоб електронний проміньпроникав крізь них; наприклад, таким способом можна аналізуватиіндивідуальні молекули, віруси і стінки кліток. Що ж стосується більш товстихзразків, то тут після відтінення необхідно видалити органічний матеріалклітини, при цьому на поверхні зразка залишиться тільки тонкий металевий відбитокабо репліка поверхні. Ця репліка потім підсилюється вуглецевою плівкою,після чого її можна помістити на сітку і вивчати в звичайному електронномумікроскопі.

У клітинної біології особливо успішновикористовуються два методи, засновані на отриманні механічних реплік. Один зних - метод електронної мікроскопії В«заморожування-сколювання" - даєможливість вивчати внутрішню будову клітинних мембран. Клітини заморожуютьпри температурі рідкого азоту (-196'С). Заморожений блок потім розколюють лезомножа. Скол часто проходить через гідрофобну середину подвійного шару ліпідів,оголюючи внутрішню поверхню клітинних мембран. Утвориться поверхнювідколу відтіняють платиною, органічний матеріал видаляють і вивчають отриманірепліки в електронному мікроскопі.

Метод "заморожування- Травлення " використовується для вивчення зовнішньої поверхні кліток імембран. В даному випадку клітини заморожують при дуже низькій температурі ізаморожений блок розколюють лезом ножа. Зміст льоду нав...коло кліток (і вменшою мірою всередині клітин) знижують сублімацією води у вакуумі при підвищеннітемператури (процес називають вакуумної сушкою) . Ділянки клітини,піддані такому травленню, потім відтіняють для готування платиновоїрепліки.

Для того щоб домогтисявисокої якості зображення, перешкоджають утворенню великих кристалівльоду. Це можливо при прискореному заморожуванні зразка. Один з методівтакого швидкого заморожування полягає в охолодженні до - 269 В° С рідким гелієм.Особливо вражаючі результати отримують після глибокого травлення швидкозаморожених клітин. Цей метод дозволяє виявляти структури внутрішньоговмісту клітин, демонструючи їх тривимірну організацію з винятковоючіткістю.

Оскільки в цьому випадку вмікроскопі під вакуумом спостерігають не зразки, а репліки, отримані післявідтінення металом, методи заморожування-сколювання і заморожування-травленняможна використовувати для вивчення заморожених нефіксованих клітин і виключитиризик прояву артефактів, викликаних фіксацією.

Використовуючи дляконтрастування відтінення солями важких металів, можна спостерігати велектронний мікроскоп ізольовані макромолекули, наприклад, ДНК або великівіруси.

На відміну відОднаккартина.З іншого боку,об'єкта.КористуючисьЦе робитьЗа

РозшифровкаВ даний часСаме
життєдіяльності.

Причастотах.Для вивченняСигнали,фосфат.

значення.

Один зВони можутьплазматичної мембрани.часу.

єсьмефективний і досить широко використовуваний метод, однак важливо пам'ятати, що вданому випадку процедурі мікроін'єкції піддається кожна клітина окремо,тому кількість клітин обмежена. Для підвищення проникності клітиннихмембран використовують потужний електричний розряд або хімічний вплив,наприклад, розчином детергенту низької концентрації. Електричний розрядстворює в плазматичній мембрані великі пори без пошкодження внутрішньоклітиннихмембран. Ці пори залишаються відкритими протягом декількох хвилин і навіть годин вЗалежно від типу клітин та інтенсивності електричного впливу. Черезці пори макромолекули можуть швидко входити в цитозоль чи залишати його. Приобмеженому впливі мембрана багатьох клітин відновлюється і клітинивиживають. Третій метод введення в клітини великих молекул полягає у злиттічасток, оточених мембраною і містять необхідні молекули, зплазматичною мембраною клітини.

Розділ III Методикультивування клітин і визначення їх складу

Структуру органел івеликі молекули можна вивчати під мікроскопом; для локалізації специфічнихмолекул в клітці розроблені ефективні методи фарбування. Однак щоброзібратися в молекулярних основах клітинної організації, необхідний детальнийбіохімічний аналіз. На жаль, біохімічні методи передбачаютьвикористання значної кількості клітин і в процесі дослідження клітинируйнуються. Якщо в якості зразка для біохімічного аналізу використовуватишматочок тканини, то після руйнування буде отримана суміш фрагментів різнихклітин. І якщо тканина утворена клітинами різного типу, що скоріше єправилом, ніж винятком, то розібратися в цій суміші буде просто неможливо.Для того, щоб витягти максимум інформації про всіх клітинах, складових тканини,розроблені методи розділення тканин на клітини і методи виділення окремихтипів клітин. Отриману щодо гомогенну популяцію клітин можнапіддавати аналізу безпосередньо, або попередньо розмноживши їх шляхомкультивування.

3.1 Методикультивування клітин

Більшість видів клітинрослин і тварин в сприятливих умовах здатні вижити, розмножитися інавіть диференціюватися. Використовуючи методи культури тканини, можна вивчати клітинипід мікроскопом або аналізувати їх біохімічно. Крім того, додаючи вкультуральний посудину і видаляючи з нього специфічні молекули, такі, як гормониабо фактори росту, ми можемо судити про їх вплив на клітини. Застосуваннязмішаних культур дозволяє вивчати взаємодію між різними типамиклітин.

У наш час культуризазвичай готують з клітинної суспензії, отриманої шляхом дисоціації тканини.Більшість клітин, що утворюють тканини багатоклітинних організмів, на відміну відбактеріальних клітин не здатні рости в суспензії. Для росту і поділу їмнеобхідна тверда поверхня. Спочатку, коли метод культивування тількиз'явився, в якості механічної опори використовували згусток плазми, але вНині його зазвичай заміняють поверхнею пластикової культуральноїчашки. Клітини дуже розрізняються по своїх потребах; деякі з нихздатні рости або диференціюватися тільки в тому випадку, якщо культуральначашка покрита компонентами позаклітинного матриксу, наприклад колагеном.

Розроблено спеціальнісередовища певного хімічного складу, що використовуються для культивуванняклітин різних типів. Поряд з низькомолекулярними речовинами вони містятьодин або декілька різних білкових факторів росту, необхідних клітинам длявиживання і проліферація в культурі: наприклад, деяким нервовим клітинам, як вкультурі, так і в організмі тварини необхідні слідові кількості фактора,стимулюючого зростання нервів. Були відкриті і інші фактори подібного типу,мають життєво важливе значення для розвитку клітин певних типів іпідтримання їх нормального існування.

Більшість клітинссавців у культурі гине після певного числа поділів; клітинишкіри людини, наприклад, перш ніж загинути, діляться 50-100 разів. Існуєприпущення, що обмежений термін життя клітин в культурі відображаєобмежений термін життя організму, з якого були отримані ці клітини. Інодів культурі з'являються мутантні клітини, які практично безсмертні. Вониможуть розмножуватися нескінченно і утворюють клітинну лінію. Ці клітини кращеростуть на твердій поверхні, і після утворення безперервного шару їхзростання, як правило, припиняється.

Зазвичай мутантні клітини,здатні до безперервного поділу, все ж відрізняються від ракових клітин,здатних до безперервного поділу. На відміну від інших клітинних ліній раковіклітини можуть рости, не прикріплюючись до якої твердої поверхні, іутворюють в культуральних чашках популяцію більш щільну, ніж популяції звичайнихклітин. Аналогічне властивість можна викликати експериментально і у нормальнихклітин шляхом трансформації їх опухолеродного вірусу чи якимосьз'єднанням. Отримані таким чином неопластичних трансформовані клітиннілінії здатні викликати утворення пухлин після введення в організм тварин.І трансформовані, і нетрансформованих клітинні лінії служать джереломвеликої кількості клітин одного типу і тому представляють велику цінністьдля дослідника. Такі клітинні лінії мають ще ту перевагу, що при -70 В° С їх можна зберігати невизначено довго і при цьому вони зберігають здатністьвиробляти життєздатні клітини після розморожування.

Генетичну однорідністьклітинних ліній можна посилити ще більше шляхом клонування, т. тобтовиділивши окрему клітку і дозволивши їй проліферіровать до утворення великоїколонії. Клон - це популяція клітин, що походять з однієїклітини-попередника. Клонування клітин використовується в основному для отриманняклітинних ліній, у яких мутація торкнулася певні гени. Дослідженнятаких мутантних клітин, дефектних по специфічному білку, дозволяє дізнатисябагато нового про функції білка в нормальних клітинах.

Дві клітини, зливаючись,утворюють гетерокаріони - одну комбіновану клітку з двома ядрами.Зазвичай, щоб здійснити злиття клітин, клітинну суспензію обробляютьінактивованими вірусами, або поліетиленгліколем. Обидва цих агента пошкоджуютьплазматичну мембрану клітини, що і приводить до злиття клітин. Освітагетерокаріонов дає можливість змішувати компоненти двох окремих клітин зметою вивчення їх взаємодії. Саме в дослідах по гібридизації клітин миші іклітин людини вперше були отримані дані, що свідчать про те, щобілки поверхні клітин людини і миші, що перебували спочатку на своїхполовинках гетерокаріони, швидко дифундують і перемішуються по всій йогоповерхні.

Після закінченняпевного часу гетерокаріони діл...иться мітотично, утворюючи в результаті гібридну клітку. Ядерні оболонки втрачають хромосоми людини. В результаті утворюєтьсябезліч гібридних ліній "миша-людина", кожна з яких міститьодну або кілька хромосом людини. Це явище виявилося корисним длякартування і локалізації генів у геномі людини. Наприклад, інсулін людинисинтезують тільки ті гібридні клітини, які містять хромосому 11 людини,отже, ген, що кодує інсулін, знаходиться саме на цій хромосомі.

3.2 Фракціонуванняклітинного вмісту

При обережному застосуванніметодів руйнування деякі органели зберігаються в інтактному стані (ядра,мінтохондріі, апарат Гольджі, лізосоми і Пероксисома). Таким чином,суспензія клітин перетворюється в розчинний екстракт, що містить доситьгрубу суспензію пов'язаних з мембраною частинок, що володіють характернимирозмірами, зарядом і щільністю.

Після того як на початку40-х років почали використовувати Препаративна центрифугу, розділення різнихкомпонентів гомогенату стало цілком реальним. Така обробка ділить клітиннікомпоненти по їх розміру: більші частки при центрифугуванні рухаютьсяшвидше. Великі компоненти екстракту, в тому числі ядра або незруйнованіклітини, швидко осідають при відносно низьких швидкостях і утворюють осад надні центріфужной пробірки.

ультрацентрифугрозділяє клітинні компоненти не тільки по масі, але і по плавучої щільності.У цьому випадку зразок седіментірует в круговому градієнті, утвореномувисококонцентрованим розчином сахарози або хлористого цезію. Компонентиклітин опускаються за градієнтом до тих пір, поки не досягнуть ділянки, щільністьрозчину в якому дорівнює власній щільності компонентів. Подальшоїседиментації компонентів не відбувається і вони "застряють" на цьомурівні. Таким чином, в центріфужной пробірці виникає набір різних смуг,причому смуги прилеглі до дна пробірки, містять компоненти максимальноїплавучої щільності. Даний метод настільки чутливий, що з його допомогоюможна відокремлювати немічених макромолекули від макромолекул, що містять важкіізотопи ( 13 С або 15 N).

фракціонованийклітинні екстракти, звані також безклітинним системами, широковикористовуються для вивчення внутрішньоклітинних процесів. Тільки працюючи збезклітинним екстрактами можна встановити молекулярний механізм біологічнихпроцесів, оскільки лише в цьому випадку досліджуваних механізм може бути вивченийв чистому вигляді без перешкод, створюваних відбуваються в клітці побічнимиреакціями. Використання безклітинних систем принесла перші тріумфальний успіхпри вивченні механізмів біосинтезу білка. Відправною точкою в даному випадкупослужив неочищений клітинний екстракт, здатний транслювати молекули РНК вбілок. Після багаторазового фракціонування цього екстракту були отриманірибосоми, РНК і різні ферменти, складові в сукупності апаратбіосинтезу білка. Після отримання окремих компонентів у чистому вигляді їх можнабуло додавати в систему і виключати з неї і таким чином уточнювати ролькожного компонента в процесі біосинтезу білка. Ця ж "система трансляціїin vitro "виявилася корисною для розшифровки генетичного коду-звикористанням в якості матричної РНК (мРНК) штучних полінуклеотидіввідомого складу.

В даний часрізні системи трансляції in vitro застосовують і для визначення механізмів розподілубілків з різних внутрішньоклітинним компартментам, а також для ідентифікаціїбілків, кодованих очищеними препаратами мРНК (очистка мРНК є важливиметапом у процедурі клонування генів).

Багато чого з того, що мизнаємо про молекулярної біології клітини, відкрито при вивченні безклітинних систем.Саме так вдалося з'ясувати механізми реплікації ДНК, транскрипції ДНК,сплайсингу РНК, м'язового скорочення і транспорту частинок по микротрубочкам.Аналіз в безклітинних системах увазі повне розділення всіхскладових її індивідуальних макромолекулярних компонентів і, зокремавсіх білків, що входять в систему. Методи розділення білків розглядаються внаступних розділах.

В даний час хроматографія є одним з методів,найбільш широко використовуваних для фракціонування білків. Найбільшепоширення набула розподільна хроматографія.

Білки найчастіше розділяють методом хроматографії на колонках (стовпчикхроматографія). У цьому випадку суміш молекул в розчині пропускають черезколонку, що містить твердий пористий матрикс. У результаті взаємодії зматриксом різні білки проходять через колонку з різною швидкістю. Післятого як різні білки досягнутий в певній послідовності дна колонки,їх збирають окремими фракціями. В даний час розроблено і застосовуєтьсябезліч матриксу різних типів, використовуючи, які можна ділити білкизгідно їх заряду (іонообмінна хроматографія), гідрофобності (гідрофобнахроматографія), розміру (хроматографія гель-фільтрацією) або здатностізв'язуватися різними хімічними групами (аффинная хроматографія).

На кожному, етапіколонкової хроматографії вміст білка в суміші збільшується не більше ніж в20 разів, і тому виділити зі складної суміші білків окремий білок за один циклпрактично неможливо. На частку кожного білка, як правило, припадає менше1/1000 всього білка клітини, і для його очищення потрібно послідовневикористання декількох різних типів колонок.

Набагато більш ефективнийметод афінної хроматографії (хроматографія по спорідненості). В основі цього методулежать біологічно важливі взаємодії, що відбуваються на поверхні білковихмолекул. Так, при ковалентном зв'язуванні субстрату ферменту з матриксом,наприклад, з полісахаридними кульками, фермент специфічно утримуєтьсяматриксом і може бути елюірован (змито) практично в чистому вигляді. Афінніколонки мають високий ступінь специфічності; за один цикл хроматографіїможна домогтися дуже високого ступеня очищення (1000-10000 разів). Застосуванняколонок високоефективної рідинної хроматографії забезпечує високий рівеньдозволу і значну швидкість процесу. Ось чому саме цей методнадзвичайно популярний зараз для поділу і білків, і малих молекул.

Білки зазвичай несуть сумарнийпозитивний чи негативний заряд, обумовлений наявністю на їх поверхніпозитивно або негативно заряджених груп амінокислот. Якщо білковімолекули помістити в електричне поле, вони починають переміщатися зішвидкістю, яка визначається їх сумарним зарядом, а також формою ірозмірами. Цей феномен лежить в основі електрофорезу - методу розділення сумішейбілків у вільних водних розчинах і в твердому пористому матриксі.

У середині 60-х років буврозроблений модифікований метод електрофорезу - електрофорез вполіакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію (ДСН-ПААГ). Привикористанні даного методу білки мігрують в інертному матриксі - поліакриламідномугелі з високим вмістом поперечних зшивок. При цьому білки знаходяться врозчині, що містить потужний, негативно заряджений детергент - додецилсульфатнатрію або ДСН (SDS).

Зв'язуючись з гідрофобнимиділянками білкової молекули, цей детергент викликає розгортання білковихмолекул в довгі витягнуті ланцюга. Розгортаючись, окремі білкові молекулизвільняються з комплексів з білками або молекулами ліпідів і солюбілізіруютсяв розчині детергенту.

Кожна молекула білкапов'язує значна кількість негативно заряджених молекул детергенту,загальний заряд яких перевершує загальний заряд білка. З цієї причини білок післятого, як буде докладено напруга, почне рухатися в напрямкупозитивного електрода. Білки одного розміру поводяться схожим чином,оскільки, по-перше, їх природна структура повністю порушена ДСН так, що їхформа ідентична, по-друге, вони пов'язують однакову кількість ДСН інабувають однаковий, негативний заряд. Великі білки, що володіють великимзарядом, піддаються дії значних електричних сил, а також більшсуттєвого гальмування. У звичайних розчинах ці ефекти взаємно погашаються,але в порах поліакриламідного гелю, діючого як молекулярне сито, великібілки гальмуються значно сильніше, ніж малі білки. Внаслідок цього складнасуміш білків ділиться на ряд смуг, ро...зташованих у відповідності з їхмолекулярною масою. Використовуючи барвники, можна виявити основні фракціїполіпептидів.

Метод ДСН-електрофорезубілків у поліакриламідному гелі значно потужніше будь-якого іншого методуфракціонування білків, відомих раніше, хоча б тому, що може бутивикористаний для виявлення будь-якого білка незалежно від його розчинності у воді.При використанні цього методу поліпептиди розділяються строго за розміром,тому з його допомогою можна отримати інформацію про суб'едінічние складі будь-якогокомплексу і про молекулярній масі білків, створюючих цей комплекс.

Метод двовимірногогель-електрофорезу , в якому об'єднані дві різні процедуриподілу, дозволяє ідентифікувати більше 1000 білків. Результати при цьомуотримують у вигляді "двовимірної" білкової карти.

При роботі даним методомна першому етапі білки поділяють за їх заряду. Для цього зразок поміщають уневеликий обсяг розчину, що містить неіонний (незаряджений) детергент -меркаптоетанол, і в якості денатуруючого агента - сечовину. Дисоційованомуполіпептидні ланцюги поділяють методом ізоелектричного фокусування,заснованому на зміні заряду білкової молекули при зміні рН навколишньогосередовища. При ізоелектричної фокусуванні білки піддаються електрофорезу ввузької трубочці, заповненої поліакриламідному гелем, в якому за допомогоюспеціальних буферів створюється градієнт рН. Під дією електричного полякожен білок переміщається в ту зону градієнта, яка відповідає йогоізоелектричної точці і залишається в ній. Так відбувається поділ білків водному напрямку двовимірного гель-електрофорезу.

На другому етапі трубочкагелю, що містить розділені білки, знову піддається електрофорез, на цейраз в напрямку перпендикулярному того, що на першому етапі. У цьому випадкуелектрофорез ведуть у присутності ДСН і білки поділяють за їх молекулярноїмасі, як в одновимірному ДСН-ПААГ. Нерозділеними в результаті залишаються тількиті білки, які неможливо розрізнити як по ізоелектричної точці, так і попослідовності.фрагментів.хроматографії. Його також

В даний часПотенційноЗмінаКожнаантитіл.електронної мікроскопії.поліакриламідному гелі.антитіл.В результаті утворюєтьсякомпонента.Якщоплазматичну мембрану.
Технологіярекомбінантних ДНК

КласичнийЦейбілка.

Технологія рекомбінантнихрозшифровувати складні механізми регуляції експресії генів у еукаріотів. Здопомогою методів генної інженерії вдалося у великій кількості отримати багатоЗастосування

Технологія рекомбінантнихбактерій.

Основнакомпонентів.

Для захисту від молекулчужорідних ДНК, здатних проникнути в клітину і викликати її трансформацію, багатобактерії виробляють ферменти рестріцірующіе нуклеази , здатнізруйнувати чужорідну ДНК. Кожен такий фермент розпізнає в ДНК специфічнупослідовність з 4-6 нуклеотидів. Відповідні послідовності вгеномі самих бактерій замасковані метилуванням залишків А і Ц, але будь-якачужорідна молекула ДНК, потрапивши в клітину, негайно розпізнається Нуклеази, і обидвіланцюга її ДНК розрізають. В даний час відомо більше 100 таких ферментів,більшість з яких пізнає різні послідовності нуклеотидів.

Порівняння розмірівфрагментів ДНК, отриманих після обробки певної ділянки генома наборомрестріцірующіх нуклеаз, дозволяє побудувати рестрикційної карту, наякій вказано положення кожного сайту рестрикції щодо іншихрестрикційних ділянок. Короткі фрагменти, розділені електрофорезом абохроматографією, секвеніруют, тобто визначається послідовністьнуклеотидів.

4.3 Секвенування ДНК

Для визначення нуклеотидної послідовності в ДНК булирозроблені два методи:

1.Методз використанням "мінус-й плюс"-систем ("мінус-плюс"-метод,метод Сенгера).

2.Методз використанням діметілсульфата і гідразину (метод Максама-Гілберта).

Метод Сенгераполягає в отриманні коротких ділянок ланцюга ДНК на матриці батьківської ДНК,при цьому використовуються різні унікальні за властивостями ферменти. Зіставленняотриманих фрагментів дозволяє встановити вихідну послідовність.

МетодМаксама-Гілберта побудований на розщепленні фрагментів ДНК за певнимипідставам хімічними агентами. Чергування цих розщеплень на однорідномуматеріалі (спочатку, припустимо, по А, потім по Т, Г, С) дозволяє отримати наборикоротеньких фрагментів. Зіставленням встановлюють загальну послідовність.

Незважаючи накоротеньке виклад суті методів, самі методи є дуже складноютехнічною процедурою. Але, все-таки, дані методи вдалося автоматизувати,що дозволяє досить швидко встановлювати послідовності нуклеотидів вгенах, а також призвело до розшифровки генетичних карт багатьох організмів, у томучислі і людини.

4.4 Клонування ДНК

Багато рестріцірующіенуклеази вносять розриви в два ланцюги ДНК зі зміщенням на декілька нуклеотидів,так що на кінцях утворюються короткі одноцепочечниє ділянки. Ціодноцепочечниє кінцеві ділянки мають здатність утворювати комплементарніпари основ з будь-яким іншим одноланцюгових ділянкою, отриманим за допомогоютого ж ферменту, і тому їх називають липкими кінцями . Липкі кінці,утворені рестрикційної ферментами, дозволяють легко з'єднати два будь-якихфрагмента ДНК воєдино за умови, що ці фрагменти утворилися післядії однієї і тієї ж рестріцірующей нуклеази (рестріктази). Таким чином,фрагмент ДНК будь-якого походження можна вбудувати в очищену ДНК авторепліцірующегосягенетичного елемента, яким, як правило, є плазміда абобактеріальний вірус. Вихідний фрагмент може відбуватися прямо з геномної ДНК,або з кДНК (комплементарної ДНК), тобто з ДНК, отриманої копіюваннямматричної РНК.

4.5 Гібридизаціянуклеїнових кислот

Якщо водний розчин ДНКнагріти до 100 В° С і сильно защелочіть (рН 13), то комплементарні парипідстав, що утримують два ланцюги подвійної спіралі разом, зруйнуються і ДНКшвидко дисоціює на дві

ланцюга. Цей процес,званий денатурацією ДНК, раніше вважався необоротним. Однак у 1961році було виявлено, що якщо комплементарні ланцюга ДНК витримати притемпературі 65 В° С, вони легко спарюються, відновлюючи структуру подвійноїспіралі (процес, який отримав назву ренатурації або гібридизації )Подібні процеси гібридизації можуть відбуватися між двома будь-якими одинарнимиланцюгами нуклеїнових кислот (ДНК-ДНК, РНК-РНК, ДНК-РНК) за умови, що вонимістять комплементарні послідовності нуклеотидів.

Цей метод доситьефективний для пошуку неідентичних, але споріднених генів; наприклад, післяклонування цікавлять дослідника генів миші або курки, їхпослідовності можуть бути використані для пошуку відповідних генів угеномі людини.

ДНК-зонди застосовують і вреакціях гібридизації з РНК для виявлення експресії даного гена в клітинах. Вцьому випадку ДНК-зонд, що містить частину послідовності гена, намагаютьсягібрідізовать з РНК, виділеної з аналізованої клітини. Якщо гібридизаціявідбувається, проводять кількісне визначення експресії. Більшеудосконалені методики припускають обробку ДНК-зонда специфічниминуклеазами для виявлення ділянок, гибрідизуючою з клітинної РНК. Такимчином можна визначити початкові і кінцеві ділянки транскриптів РНК; цей жеметод може бути корисний для з'ясування точних меж ділянок, вирізаних зтранскриптів РНК в процесі сплайсингу РНК.

4.6 Методи рекомбінантнихДНК

Розробка методіврекомбінантних ДНК зробила доступними будь-які клітинні білки (включаючи мінорнібілки) у великих кількостях. Для цього клонують ген потрібного білка і потімвбудовують його в спеціальну плазміду, іменовану клонуючим вектором. Цейвектор сконструйований таким чином, що будучи введеним в бактерії, дріжджіабо клітини ссавців відповідного типу, він забезпечуєвеликомасштабний синтез цього білка. Таким чином, якщо раніше для детальнихструктурних або функціональних досліджень були доступні лише деякі білки,в даний час практично... всі білки клітини можуть бути предметом подібнихдосліджень.

Отримати мутантів, уяких порушена реплікація ДНК або, наприклад, розвиток ока, в принципідосить просто. Однак, щоб зв'язати цей дефект із зміною конкретногобілка, можуть знадобитися роки. Технологія рекомбінантних ДНК дала в рукидослідників зовсім інший підхід: аналіз починається з білка і завершуєтьсястворенням мутантної клітини або цілого організму. Оскільки такий підхід попорівнянні з традиційним напрямком генетичного аналізу від гена до білка представляєтьсязворотним, його зазвичай називають зворотного генетикою.

Зворотній генетика починається з виділення з клітинипотрібного білка. Ген цього білка клонують та визначають його нуклеотиднупослідовність; потім цю послідовність змінюють біохімічними методами,створюючи мутантний ген, що кодує змінену форму білка. Потім такий генвводять в клітину, де він може вбудуватися в хромосому в процесі гомологічноїрекомбінації і перетворитися таким чином в постійний елемент геному. Якщовбудований ген експресується, то несуча його клітка і всі її нащадки будутьсинтезувати змінений білок. У тому випадку, коли змінений in vitro генвводять в запліднену яйцеклітину, виходить багатоклітинний мутантнийорганізм. Деякі з таких трансгенних організмів передадуть цей генсвоїм нащадкам в якості постійного елемента клітин зародкової лінії. Така генетичнатрансформація в даний час стає звичайною процедурою для плодовихмушок або ссавців. В принципі на сьогоднішній день абсолютно реальна ітрансформація людини, але такі експерименти не виконують зі страху передможливими генетичними порушеннями, які можна виключити у осіб, що сталиоб'єктом таких досліджень.

Технологія рекомбінантнихДНК зробила істотний вплив на всю клітинну біологію, дозволяючидослідникам вирішувати завдання, які раніше здавалися нерозв'язними, наприклад,визначати функції багатьох знову відкритих білків і їх індивідуальних доменів,розшифровувати складні механізми регуляції експресії генів у еукаріотів. Здопомогою методів генної інженерії вдалося у великій кількості отримати багатобілки, що беруть участь у регуляції клітинної проліферації і розвитку.

Висновок

В ході виконання даноїкурсової роботи були розглянуті різноманітні методи, які використовуються длявивчення клітин на сучасному етапі наукового розвитку. Наведені у форматіданої роботи методи можна систематизувати на основі їхнього підходу додослідженню. Можна виділити методи статичного дослідження, такі як:

а) методиоптичної мікроскопії;

б) методиелектронної мікроскопії;

в) методифракціонування клітинного вмісту;

г)рентгеноструктурний аналіз і метод ЯМР.

Також виділимо методидослідження функціонування клітини (тобто безпосередньо впливають на їїфункціонування):

а) методикамічених ізотопів і антитіл;

б) методивнутрішньоклітинних ін'єкцій;

в) методиклітинних культур і тканин;

г) методигібридизації та клонування ДНК.

Набір функціональнихметодів дуже багатий і не повністю висвітлений у даній роботі, оскільки не можливоописати всі їх разнооразіе в такому форматі, наприклад, не враховано багаторізноманітних генетичних методів, які допомагають встановити функції багатьохмолекул, а також механізми спадкування.

З викладеного матеріалувипливає, що сучасна клітинна біологія оперує безліччю методів,дозволяють досліджувати клітку не тільки в її статичному прояві, але йрозібратися в її функціонуванні на молекулярному рівні. А деякому родівінцем сучасних досягнень в клітинній біології є методи генноїінженерії.

Список використаноїлітератури

1. Айала Ф. Кайгер Дж. Сучаснагенетика. У 3-х т. Пер з англ.: - М.: Мир, 1987.

2. Албертс Б. та ін Молекулярнабіологія клітини. В 5-ти томах. М.: Мир, 1986 - 1987.

3. Зенгбуш П. Молекулярна та клітиннабіологія. У 3-х т. М.: Світ, 1982.

4. Ленинджер А. Основи біохімії. У 3-хт. М.: Світ, 1985.

5. Льюін Б. Гени. М.: Мир, 1987.

6. Страйер Л. Біохімія. У 3-х т. М.:Світ, 1985.

7. Третяк А. П. Молекулярна біологія.Чернігів. 1999.