Протеоміка

А.А. Замятніним, доктор біологічних наук, Інститутбіохімії ім. А.Н.Баха РАН

Нашрозповідь буде присвячений одній з наймолодших фундаментальних наук (якщо ненаймолодшою), яка народилася всього лише кілька років тому разом з тими, хтоще зараз навчається в початковій школі. На відміну від багатьох інших наук пропротеоміці можна точно сказати, за яких обставин вона виникла, вказатирік, коли з'явилося її назву і хто його придумав.

Почнемоз обставин. У другій половині XX в. бурхливо розвивалися аналітичніметоди біохімії, молекулярної біології та обчислювальної техніки. Видатніуспіхи, досягнуті в цих областях, призвели до можливості розшифровки величезнихпослідовностей основ нуклеїнових кислот і до запису повного геномаживого організму. Вперше повний геном був розшифрований в 1980 р. [1] у бактеріофага phi Х-174 (близько 5.103 підстав), потім у першої бактерії - Haemophilusinfluenzae (1, 8.106 підстав) [2]. А c завершенням XX в. була закінченаграндіозна робота по розшифровці повного генома людини - виявленнюпослідовності приблизно 3 млрд основ нуклеїнових кислот [3]. На цюроботу було витрачено кілька мільярдів доларів (приблизно по одному доларуна одну підставу). Всього ж вже розшифровані геноми кількох десятків видівживих організмів. Саме в цей період виникли дві нові біологічні науки:в 1987 р. вперше в науковій пресі було використано слово В«геномікаВ» [4], а в 1993 р. - В«біоінформатикаВ» [5].

Укожного біологічного виду частина генома представлена ​​ділянками, кодирующимиамінокислотні послідовності білків. Наприклад, таких ділянок у людининалічується близько 100 000 (за деякими оцінками, це число може досягати300 000, а з урахуванням хімічно модифікованих структур - декількохмільйонів). Здавалося б, знаючи повний геном і генетичний код, можна шляхомтрансляції отримати всі відомості про структуру білків. Проте все не так просто.Поступово ставало очевидним, що в даній розглянутій клітинноїсистемі організму немає кореляції між наборами мРНК і білків. Крім того, багатобілки, синтезовані на рибосомах відповідно до нуклеотидноїпослідовністю, після синтезу піддаються хімічним модифікаціям і можутьіснувати в організмі в модифікованій та немодифікованої формах. І щеважливо те, що білки володіють різноманітними просторовими структурами,які на сьогоднішній день не можна визначити по лінійним послідовностямнуклеотидів і навіть амінокислот. Тому пряме виділення і визначення структурусіх функціонуючих білків залишається як і раніше актуальним завданням (прямевизначення структури на сьогоднішній день здійснено приблизно лише для 10%білків людини). Так, на додаток до геноміки з'явився термін В«протеомікаВ», об'єктомдослідження якої є протеом (від англ. PROTEins - білки і genOMe -геном). А в науковій пресі згадка про протеома вперше з'явилося в 1995 р. [6].

Сліддодати, що велику роль у життєдіяльності організмів відіграють численнікороткі фрагменти білкових попередників, які називаються олігопептиди,або просто пептидами. Саме через них спостерігається такий різнобій в оцінцікількості білково-пептидних компонентів у представників одного біологічноговиду. Тому поряд з термінами В«протеомВ» і В«протеомікаВ» в даний час вжевживаються такі терміни, як В«пептидомВ» і В«пептідомікаВ», що представляютьсобою частину протеома та протеоміки. Про різноманіття структури і функцій білків іпептидів на сторінках газети В«БіологіяВ» нами було розказано раніше [7].

Отже,сформулюємо визначення нових наук, які з'явилися за життя нинішньогомолодого покоління та які тісно взаємопов'язані один з одним (рис. 1).

Рис.1. Схема, що ілюструє повну взаємозв'язок трьох нових біологічних наук

Геноміка- Наука, що займається вивченням структури і функцій генів (геном - сукупністьвсіх генів організму).

Біоінформатика- Наука, що займається вивченням біологічної інформації за допомогоюматематичних, статистичних і комп'ютерних методів.

Протеоміка- Наука, що займається вивченням сукупності білків і їх взаємодій в живихорганізмах (протеом - сукупність всіх білків організму).

Відзначимотакож, що протеоміка в загальних рисах включає в себе структурну протеоміка, функціональнупротеоміки та прикладну протеоміки, які ми розглянемо окремо.

Структурна протеоміка

Найбільшяскравою особливістю біології є різноманітність. Воно проглядається на всіхрівнях біологічної організації (біологічні види, морфологія, хімічнаструктура молекул, мережа регуляторних процесів і т.д.). У повній мірі цевідноситься і до білків. Масштаб їх структурного розмаїття досі до кінцяне виявлено. Досить сказати, що кількість амінокислотних залишків в одному білкуможе становити від двох (мінімальна структура, має пептидних зв'язок) додесятків тисяч, а білок Титиний людини містить 34 350 амінокислотних залишківі на сьогоднішній день є рекордсменом - найбільшої з усіх відомихбілкових молекул.

Щоботримати відомості про протеома, необхідно спочатку його виділити і очистити відінших молекул. Оскільки число білків у всьому протеома (тобто у всьомуорганізмі) вельми велике, зазвичай беруть тільки частину організму (його орган аботканина) і різними методами виділяють білкову компоненту. За майже 200-річнуісторію вивчення білків розроблено безліч методів виділення білків - відпростого сольового осадження до сучасних складних методів, що враховуютьрізні фізичні і хімічні властивості цих речовин. Після отримання чистоїфракції індивідуального білка визначається його хімічна структура.

Вструктурної протеоміці проводиться визначення структури не одного, а відразубезлічі білків, і до теперішнього часу для цього розроблений спеціальний циклпроцедур і створений арсенал відповідних високоточних приладів. (Повний набіробладнання для протеомних досліджень коштує більше одного мільйона доларів.)

Рис.2. Інструменти протеоміки

Нарис. 2 наведена схема лабораторного циклу від приготування зразка довизначення його структури. Після виділення і очищення (на малюнку представленийвже виділений і очищений препарат) за допомогою двовимірного електрофорезупроводиться поділ білків. Це поділ йде за двома напрямками: в одномурозділяються молекули білка, що мають різну масу, в іншому - різнийсумарний електричний заряд. В результаті цієї найтоншої процедури наспеціальному носії однакові молекули групуються, утворюючи макроскопічніплями, причому в кожному плямі містяться тільки однакові молекули. Число плям,тобто число різних білків або пептидів, може становити багато тисяч (рис. 3, 4),і для їх дослідження використовуються автоматичні пристрої для обробки іаналізу. Потім проводиться відбір плям і введення містяться в них речовин всложнейший фізичний прилад - мас-спектрометр, за допомогою якого івизначається хімічна (первинна) структура кожного білка.

Рис.3. Приклад двовимірної Електрофореграми білків з екстракту печінки миші [8]

Рис.4. Приклад двовимірної Електрофореграми пептидів з цереброспінальної рідинилюдини [9]

Рис.5. Нуклеотидних послідовність гена, що кодує сироватковий альбумінлюдини

Первиннуструктуру білка можна також визначити, користуючись результатами геноміки табіоінформатики. На рис. 5 дана повна структура гена сироваткового альбумінулюдини. Вона містить 1830 азотистих основ, які кодують 610 амінокислотнихзалишків. Цей ген, як і абсолютна більшість інших, починається з кодонуatg, що кодує залишок метіоніну, і закінчується одним з стоп-кодонів, вданому випадку taa. Таким чином кодується структура, що складається з 609амінокислотних залишків (рис. 6). Однак ця структура - молекула ще несироваткового альбуміну, а лише його попередника. Перші 24 амінокислотнихзалишку являють собою так званий сигнальний пептид, який припереході молекули з ядра в цитоплазму відщеплюється, і тільки після цьогоутворюється структура сироваткового альбуміну, одержувана при виділенні цьогобілка. У підсумку дана молекула містить 385 амінокислотних з...алишків.

Рис.6. Амінокислотна послідовність попередника сироваткового альбумінулюдини, транслювати з нуклеотидної послідовності за допомогоюгенетичного коду

Рис.7. Просторова (третинна) структура молекули сироваткового альбумінулюдини

Однакамінокислотна послідовність не розкриває просторову структурубілка. З точки зору термодинаміки, витягнута лінійна структура енергетичноневигідна, і тому вона специфічним для кожної послідовності чиномзгортається в унікальну просторову структуру, яка може бутивизначена за допомогою двох потужних фізичних методів - рентгеноструктурногоаналізу та методу ядерного магнітного резонансу (ЯМР-спектроскопії). За допомогоюпершого з них визначені просторові структури вже декількох тисячбілків, у тому числі і сироваткового альбуміну людини, зображення якогопредставлено на рис. 7. Ця структура, на відміну від первинної (амінокислотноїпослідовності), називається третинної і в ній добре видно спіральділянки, які є елементами вторинної структури.

Такимчином, задача структурної протеоміки зводиться до виділення, очищення, визначеннюпервинної, вторинної та третинної структур усіх білків живого організму, а їїосновними засобами є двовимірний електрофорез, мас-спектрометрія ібіоінформатика.

Біоінформатика білків

Існуваннявеличезної кількості різноманітних білків призвело до необхідності створенняінформаційних масивів - баз (або банків) даних, в які заносилися б всевідомі про них відомості. В даний час існує безліч загальних іспеціалізованих баз даних, які доступні в Інтернеті кожному бажаючому.У загальних базах містяться відомості про всіх відомих білках живих організмів, тобтопро глобальне протеома всього живого. Прикладом такої бази єSwissProt-TrEMBL (Швейцарія-Німеччина), в якій на сьогоднішній день утримуютьсяструктури майже 200 000 білків, встановлені аналітичними методами, і щемайже 2 млн структур, які визначені в результаті трансляції з нуклеотиднихпослідовностей [10]. На рис. 8 і 9 показано кількість існуючих білків,які відомі для кожного заданого числа амінокислотних залишків. Осіабсцис на цих графіках обмежені 2000 залишків, але, як уже сказано вище, хочаі не часто, але зустрічаються і істотно більш великі молекули. З даних, представленихна малюнках, випливає, що найбільше число білків містить по кілька сотеньамінокислотних залишків. До них відносяться ферменти та інші досить мобільнімолекули. Серед більш великих білків багато таких, які виконують опорну абозахисну функції, скріплюючи біологічні структури й надаючи їм міцність.

Рис.8. Розподіл відомих (виділених) білків за кількістю амінокислотних залишків

Рис.9. Розподіл транслювати амінокислотних послідовностей по числумінокіслотних залишків

Рис.10. Розподіл відомих природних олигопептидов по числу амінокислотнихзалишків

Вглобальному протеома особливе місце займають невеликі дуже рухливі молекули, що містятьне більше 50 амінокислотних залишків і що володіють специфічним спектромфункціональної активності. Вони називаються олігопептиди, або просто пептидами.Для них, тобто для глобального пептідома, створений особливий банк даних, якийназивається EROP-Moscow. Ця назва є абревіатурою від термінаEndogenous Regulatory OligoPeptides (ендогенні регуляторні олігопептиди), івказує на те, що банк створений і базується в столиці нашої країни [11]. Насьогоднішній день розшифрована структура майже 6000 олігопептидів, виділених зпредставників усіх царств живого. Так само як і великі білки, кількістьолігопептидів з заданим числом амінокислотних залишків можна зобразити графічно(Рис. 10). Судячи з графіку, найчастіше зустрічаються олігопептиди, які містятьприблизно 8-10 амінокислотних залишків. Серед них в основному містяться молекули,які беруть участь у регуляції нервової системи, і тому називаютьсянейропептидами. Очевидно, що найшвидші процеси в живому організміздійснюються за участю нервової системи, тому пептидні регулятори повиннібути мобільними і отже невеликими. Однак, слід зазначити, що, зважаючи навеличезного структурного і функціонального розмаїття як білків, так іпептидів, для них до цих пір не створено суворої класифікації.

Такимчином, в даному випадку завданнями біоінформатики є накопичення інформаціїпро фізико-хімічних і біологічних властивостях білків, аналіз цієї інформації, каталогізаціяі підготовка інформаційної бази і обчислювальних засобів для виявленнямеханізмів їх функціонування.

Функціональна протеоміка

Наявністьв організмі того чи іншого білка дає підставу припускати, що він володіє(Або володів) певною функцією, а весь протеом служить для того, щобздійснювалася повноцінна життєдіяльність всього організму. Функціональнапротеоміка займається визначенням функціональних властивостей протеома, і розв'язуванінею завдання істотно складніше, ніж, наприклад, визначення білково-пептиднихструктур.

Очевидно,що функціонування протеома здійснюється в багатокомпонентної середовищі, вякої присутня безліч молекул інших хімічних класів - цукрів, ліпідів,простагландинів, різних іонів і багатьох інших, включаючи молекули води. Чи невиключено, що через деякий час з'являться такі терміни, як В«цукромВ», В«ліпідомВ»і їм подібні. Білкові молекули взаємодіють з оточуючими їх іншими аботакими ж, як і вони, структурами, що в кінцевому підсумку призводить до виникненняфункціональних реакцій спочатку на молекулярному рівні, а потім і намакроскопічному. Вже відомо безліч таких процесів, у тому числі зучастю білків. Серед них взаємодія ферменту з субстратом, антигену зантитілом, пептидів з рецепторами, токсинів з іонними каналами і т.д.(Рецептори та іонні канали також є білковими утвореннями). Длявиявлення механізмів цих процесів проводяться як експериментальнідослідження індивідуальних учасників взаємодії, так і системні дослідженнязасобами біоінформатики. Розглянемо кілька прикладів таких системнихпідходів.

Нарис. 11 показані представники протеома (в даному випадку пептідома) людини -різні гастрину і холецистокінін, які локалізовані в шлунково-кишковомутракті (при написанні амінокислотних послідовностей використанийстандартний однобуквеному код, розшифровка якого була дана нами раніше [7]).Функціональними частинами молекул цих пептидів є дуже схожі правіобласті. Однак пептиди володіють прямо протилежними поведінковимивластивостями: гастрин викликають у людини відчуття голоду, а холецистокінін -ситості. По-видимому, дане відмінність обумовлена ​​тим, що в первиннійпослідовності холецистокінін положення залишку тирозину Y зрушено наодин крок в порівнянні з гастрину. На тому ж малюнку наведена первиннаструктура пептиду ціоніна, отриманого з представника найпростіших хордовихCiona intestinalis (рис. 12). Його структура гомологична і гастрин, іхолецистокінін і характеризується двома залишками тирозину, що знаходяться в тихже положеннях, що і в обох зазначених пептидів. На жаль, функціональнівластивості його не вивчені. А при належному експериментальному дослідженні можнабуло б відповісти на питання, яка роль хімічної структури в цілому і залишківтирозину зокрема при прояві протилежних фізіологічних ефектів.

Рис.11. Первинні структури представників пептідома людини в порівнянні зіструктурою одного з пептидів оболочечніка

Рис.12. Оболочечнік Ciona intestinalis, що мешкає в Північному морі

Іншийприклад: на рис. 13 наведені амінокислотні послідовності дуже схожихмолекул, які також об'єднані в структурно-гомологічною сімейство. Цімолекули виявлені у вельми еволюційно далеких живих організмів - відкомах до ссавців. У першому рядку дана первинна структурабрадикініну, що містить 9 амінокислотних залишків і зустрічається у багатьохвищих організмів, у тому числі і у людини. Протягом багатьох років хімікисинтезували різні неприродні аналоги цієї молекули, щоб відповісти напитання, якою її ділянку відповідальний за взаємодію з рецептором. Близько 30 роківназад були навіть синтезовані всі мож...ливі фрагменти брадикініну - 8дипептидів, 7 тріпептідов і т.д. (Всього можливі 36 фрагментів), величинуактивності яких потім випробовували в одному і тому ж біологічному тесті.Результат виявився тривіальним: з'ясувалося, що максимальну активністьпроявляє лише вся молекула цілком, а кожен фрагмент окремо володієабо слідової активністю, або нульовий. Цю трудомістку роботу не довелося бробити, якби в той час були відомі інші брадикініни, наведені нарис. 13, і засобами біоінформатики вони були б виділені з глобальногопротеома. Представлене структурно-гомологічною сімейство наочно демонструє,що у всіх молекул є область, яка в результаті біологічної еволюціїпрактично не змінювалася (квазіконсерватівная область), і вона являєсобою молекулу брадикініну вищих живих організмів, відібрану як найбільшвчинену внаслідок еволюційного процесу.

Рис.13.живих організмів.

Рис.14.

І,структури. На рис.

Рис.15.

Рис.16.

Звичайно

Рис.17.

ОднимА.Н.метаболітів.перетвореннях.

Подібні

Таким

Отже,білки.засобів.

Перше

В

Рис.18.

Сліддіагностики.

Список літератури

1. et al.1977. V. P.

2. et al.1995. V.P.

3.Nature. 2001.

4.Res. 1988. V. P.

5.Sci. 1993. V. 700. P.

6. et al. Progress1995. V. P.

7.Замятнін А.А. 2002.№ 25-26. P. 8-13.

8.2004. V. P.

9.Lett. 2004. V. P.

10.

11.

12.- М.:

13.Арчаков А.І. мед. хімії. 2000.4.

Дляпідготовки даної роботи були використані матеріали з сайту bio.1september.ru