Рефератна тему:
СеквенуванняДНК
2009
Введення
До кінця 70-х років переддослідниками, що працювали в сфері молекулярної біології, гостро посталапроблема встановлення послідовності нуклеотидів у ланцюгу ДНК (В«секвенуванняДНК В»). Як підійти до вирішення цієї проблеми? За 10 років до того Ердманом і Беггбула вирішена задача з'ясування послідовності амінокислот в білках(В«Секвенування білківВ») в автоматичному режимі. З цим рішенням ми вжеознайомилися. Власне кажучи, новим в їх методі був тільки спосібавтоматизації. Істота ж цього методу було для хімії тривіальним. Був знайденийспосіб послідовного відщеплення по одній амінокислоті (хоча і вмодифікованому вигляді) від кінця досліджуваної білкової ланцюга з подальшоюідентифікацією кожної з отриманих таким чином простих продуктів.
Відшукання аналогічного підходудля секвенування ДНК не надихало дослідників, оскільки длясеквенування хоча б одного структурного гена належало визначатипослідовність у 1-3 тисячі нуклеотидів, не кажучи вже про всім геномі, колирахунок повинен йти на мільйони, а у вищих організмів на мільярди нуклеотидів.
Початкові способи неавтоматизованого секвенування ДНК
У 1977 році Максам і Гілбертзапропонували зовсім інший, оригінальний метод вирішення проблеми секвенування.Їм вдалося знайти хімічну реакцію, яка розщеплювала молекулу ДНК за місцемрозташування одного певного нуклеотиду. Вони позначали радіоактивною міткоюперший нуклеотид досліджуваного однониткових (після денатурації) фрагмента ДНК,представленого, зрозуміло, величезною кількістю копій. Потім проводилиреакцію розщеплення в таких умовах, що переважна більшість ниток ДНКрозривалося тільки в одному з безлічі місць, де стояв обраний нуклеотид (авсі ці місця рівноправні). Після цього продукти розщеплення направлялися дляаналізу методом електрофорезу в ПААГ. Ауторадіографія гелю виявляла наступнукартину.
Відрізки ДНК всіх можливихрозмірів, рахуючи від початку молекули до відомого (піддалося хімічнійатаці) нуклеотиду, розділилися і виявили себе смугами почорніннярентгенівської плівки. Самі короткі відрізки (в 2, 3 і навіть один першийнуклеотид) пішли в гелі далеко вперед. Більш довгі відрізки відстали тимсильніше, ніж вони були довшими. Ступінь почорніння смуг виявилася різна,оскільки число молекул ДНК, розірвалися в кожному з можливих місць було випадковим.Але при достатній кількості вихідного матеріалу всі вони були добре видні.«³дрізаніВ» частини молекул, навпаки, нічим себе в гелі не виявляли, так якне містили міченого нуклеотида.
Ця картина ще не несла в собініякої інформації про порядкові номери нуклеотидів, за якими відбулосярозрив. Однак аналогічні специфічні реакції розщеплення авторам вдалосязнайти і для решти трьох нуклеотидів. Вони змогли отримати відповіднікартини поділу відрізків ДНК і для них. Потім вони вели електрофоретичноїподіл одночасно для всіх 4-х випадків у паралельних треках одного гелю.Із зіставлення положень всіх смуг виявилося можливим отримати повнуінформацію про послідовності нуклеотидів в досліджуваному фрагменті ДНК.Дійсно, всі смуги в 4-х треках повинні знаходитися на різних рівнях,тому що довжини відповідних цим смугам відрізків ДНК будуть різнитисяміж собою хоча б на один нуклеотид. Разом з тим, нічого іншого, крімчотирьох нуклеотидів, в ДНК немає. Це означає, що сукупність всіх відрізківдискретно вичерпує всі можливі віддалення від початку молекули. Аотже, пронумерувавши всі смуги в гелі, починаючи з найвіддаленішої відстарту, сукупно за всіма чотирма треках можна отримати всю нуклеотиднупослідовність секвеніруемого фрагмента ДНК.
ауторадіографії - методреєстрації положення радіоактивно-мічених речовин у гелі шляхом фіксації їхвипромінювання на рентгенівській плівці. Адже кожному номеру, який опинився в будь-якому зтреків, буде відповідати заздалегідь відомий нуклеотид, який визначив місцерозриву ДНК при підготовці препарату саме для цього треку.
Відзначимо, що метод Максама іГілберта дозволяє визначити всю послідовність, починаючи-з першогонуклеотиду. Але представляє чималі труднощі у трактуванні результатівексперименту. Адже він вимагає впевненого визначення чергування смуг,знаходяться в різних треках. Зокрема, і таких смуг, які відповідаютьвідрізкам ДНК довжиною в кілька десятків, а то і сотень нуклеотидів з відзнакою водин нуклеотид. Тим часом умови підготовки препаратів, та й самогоелектрофорезу (наприклад, умови тепловідведення) можуть бути трохи різними длярізних треків і це може сплутати всю картину визначення послідовності.Особливо у верхніх частинах пластини гелю, де тісно зрушені смуги,відповідні довгим відрізкам. З цієї причини метод Максама і Гілберт недозволяв секвенувати фрагменти ДНК крупніше, ніж 200-300 нуклеотидних ланок.Крім того, він не піддавався автоматизації.
У тому ж 1977 році (трохи пізніше)Сенджер і співроб. запропонували інший метод секвенування ДНК. В принципі, він бувбагато в чому аналогічний описаному вище методом. Тут теж вдавалося отриматичотири набори відрізків ДНК всіх можливих розмірів, радіоактивно мічених тазакінчуються на одному з чотирьох нуклеотидів. Їх точно так само поділялиелектрофорезом в 4-х паралельних треках ПААГ, отримували чотири В«сходиВ» смугпочорніння після ауторадіографії і сукупним аналізом послідовності смугв них встановлювали послідовність нуклеотидів в досліджуваному фрагменті ДНК.Втім, не зовсім всю послідовність. Перші кілька нуклеотидів прицьому могли залишитися не визначеними по причині, яка стане зрозумілою зподальшого.
Звернемося тепер до того в чомудва методи істотно різнилися між собою. А саме, до способу отриманнявідрізків ДНК всіх можливих розмірів, що закінчуються на будь-який з 4-хнуклеотидів. Нагадаю, що Максам і Гілберт радіоактивно мітили перший нуклеотидпослідовності та хімічним способом розщеплювали досліджуваний однонитковихфрагмент ДНК по всіх місцях перебування кожного з нуклеотидів.
Сенджер і співроб. запропонуваливикористовувати той же однониткових фрагмент ДНК в якості матриці длякомплементарного синтезу по ній за допомогою ДНК-полімерази I безлічі неповнихкопій усіх можливих розмірів, що закінчуються на певному нуклеотиде. Дляцього обраний нукле-отиде повинен був бути модифікований таким чином, щобВ«Не втративши свого обличчяВ» бути включеним в зростаючу комплементарну ланцюг ДНК і... тим самим припинити її зростання, фіксуючи розмір скопійованого ділянкиматриці. Щоб отримати відрізки ДНК всіх можливих у цьому випадку розмірів,модифікований нуклеотид повинен бути наточити до суміші чотирьох нормальнихнуклеозідтріфосфатов - попередників біосинтезу ДНК теж у виглядінуклеозідтріфосфата, але в такій малій кількості, щоб зупинка синтезу привипадковому його включенні відбувалася з однаковою ймовірністю в будь-якому місцісинтезируемой копії.
Очевидно, що саме з циммодифікованим нуклеотидом слід зв'язати радіоактивну мітку, щоблокалізувати визначений ним відрізок ДНК на рентгенівській плівці післяауторадіографії. Але що ж це за модифікація? В якій частині нуклеотиду вонаможе мати місце? Очевидно, що не в самому нуклеїнових підстав. Адже длятого, щоб бути В«впізнанимВ» ДНК-полімеразою та комплементарно включеним взростаючу ланцюг ДНК-копії нуклеотид повинен В«зберегти своє обличчяВ». Значитьмодифікація повинна торкнутися дезоксирибози. Тим більше, що саме вона бере участьв побудові цукрово-фосфатного зв'язку між нуклеотидами, тобто в самомупроцесі нарощування полинуклеотидной ланцюжка.
Звернемося до малюнків 24, 25 і 26на стр. 34 і 35. Розглядаючи їх, неважко пригадати, що зв'язок між сусідніминуклеотидами утворюється за рахунок ферментативного відщеплення води від ОН-групи,якої закінчується залишок фосфорної кислоти в одному нуклеотиде (цейзалишок приєднаний в 5'-положенні В«своєїВ» дізокс...
