Зміст
Введення
1. Особливості отримання інтерферонів
2. Механізми дії інтерферонів
3. Терапевтичне застосування ІНФ людини
Висновок
Список літератури
Введення
Інтерферони являють собою білкові молекули з молекулярною масою від 15000 до 21000 дальтон, віднайдені і секретуються клітинами у відповідь на вірусну інфекцію або інші збудники.
Інтерферони (ІФН) - група аутогенних глікопротеїнів, біомеханізм дії яких пов'язаний з одночасним противірусним ефектом - активацією клітинних генів, в внаслідок чого синтезуються білки, інгібуючі синтез вірусної ДНК (РНК) і володіють імуномодулюючою ефектом - здатністю посилювати експресію антигенів на клітинних мембранах і збільшувати активність цитотоксичних Т-клітин і природних кілерів [4].
ІФН поділяються на два типи. До першого типу, чинному як інгібітори реплікації вірусу і послугами якої переважно противірусний ефект, відносяться 22 різних підтипу ІФН-О± і один підтип ІФН-ОІ. До другого типом, який виявляє іммуномодуляторную активність, відносяться ІФН-Оі.
Існує три імунологічно різних класу ІФН: ІФН-О±, ІФН-ОІ, ІФН-Оі.
До ІФН природного походження відносяться лімфобластоідний і лейкоцитарний ІФН (ІФН-О±), синтезовані відповідно стимульований моноцитами і В-лімфоцитами людини, які потім екстрагуються і очищаються; фібробластний ІФН (ІФН-ОІ), одержуваний з культури фібробластів людини, і Т-лімфоцитарний ІФН (ІФН-Оі).
До штучно синтезованих ІФН відноситься рекомбінантний ІФН-О±, який являє собою високоочищений єдиний підтип ІФН-О±, одержуваний по рекомбінантної молекулярної технології [1].
1. Особливості отримання інтерферонів
Відомі способи отримання лейкоцитарного інтерферону людини з лейкоцитів донорської крові людини, індукованих вірусами та іншими індукторами.
Основним недоліком цих способів одержання інтерферонів є ймовірність контамінації кінцевого продукту вірусами людини, такими як вірус гепатитів В і С, вірусу імунодефіциту та ін
В даний час більш перспективним визнаний спосіб отримання інтерферону мікробіологічним синтезом, який забезпечує можливість отримання цільового продукту зі значно більш високим виходом з порівняно недорогого вихідної сировини. Використовувані при цьому підходи дозволяють створити оптимальні для бактеріальної експресії варіанти структурного гена, а також регуляторних елементів, контролюючих його експресію.
В якості вихідних мікроорганізмів використовують різні конструкції штамів Pichia pastoris, Pseudomonas putida і Escherichia coli.
Недоліком використання P. pastoris в якості продуцента інтерферону, є вкрай складні умови ферментації цього типу дріжджів, необхідність суворо підтримувати концентрацію індуктора, зокрема метанолу, в процесі біосинтезу.
Недоліком використання штамів Ps. putida є складність процесу ферментації при низькому рівні експресії (10 мг інтерферону на 1 л культурального середовища). Більш продуктивним є використання штамів Escherichia coli.
Відомо велика кількість плазмід і створених на їх основі штамів Є. coli, експрессірующіх інтерферон: штами Е. coli ATCC 31633 і 31644 з плазмідами Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 або Z-pBR 322 (Pstl)/HclN SN 35-AHL6 (SU 1764515), штам Е. coli pINF-AP2 (SU 1312961), штам Е. coli pINF-F-Pa (AU 1312962), штам E.Coli SG 20050 з плазміди p280/21FN (Кравченко В.В. та ін Біоорганічна хімія, 1987, т.13, № 9, с.1186-1193), штам E.Coli SG 20050 з плазмидой pINF14 (SU 1703691), штам E.coli SG 20050 з плазміди pINF16 (RU 2054041) та ін Недоліком технологій, заснованих на використанні цих штамів, є їх нестабільність, а також недостатній рівень експресії інтерферону.
Поряд з особливостями використовуваних штамів ефективність процесу багато в чому залежить від використовуваної технології виділення та очищення інтерферону.
Відомий спосіб отримання інтерферону, що включає в себе культивування клітин Ps. putida, руйнування біомаси, обробку поліетиленімін, фракціонування сірчанокислим амонієм, гідрофобну хроматографію на фенілсілохроме С-80, рН-фракціонування лізату, його концентрування та діафільтрацію, іонообмінну хроматографію на целюлозі DE-52, елюювання в градієнті рН, іонообмінну хроматографію отриманого елюента на целюлозі СМ-52, концентрування пропусканням через касету фільтрів і гель-фільтрацію на сефадексе G-100 (SU 1640996). Недоліком цього способу крім складної багатостадійної ферментації є многостадийность при отриманні кінцевого продукту.
Відомий також спосіб отримання інтерферону, що включає в себе культивування штами E.coli SG 20050/pIF16, в LB-бульйоні в колбах в термостатированной шейкері, центрифугування біомаси, її промивку буферним розчином і обробку ультразвуком для руйнування клітин. Отриманий лізат центрифугують, промивають 3М розчином сечовини в буфері, розчиняють в розчині гуанидин хлориду в буфері, обробляють ультразвуком, центрифугують, проводять окислювальний сульфітоліз, діаліз проти 8 М сечовини, ренатурації і остаточну двостадійну хроматографію на СМ-52 целюлозі і сефадексе G-50 (RU 2054041).
Недоліками цього способу є його відносно невисока продуктивність основних етапів процесу виділення та очистки. Особливо це відноситься до ультразвукової обробці продукту, діалізу і окислювальному сульфітолізу, що призводить до нестабільності виходу інтерферону, а також до неможливості використання цього методу для промислового виробництва інтерферону.
В якості найбільш близького аналога (прототипу) може бути зазначений спосіб отримання лейкоцитарного інтерферону людини, що полягає в культивуванні рекомбінантного штаму E.coli, заморожуванні отриманої біомаси при температурі не вище -70 В° С, розморожуванні, руйнуванні клітин мікроорганізму лізоцимом, видаленні ДНК і РНК введенням в лізат ДНК-ази та очищенням виділеної нерозчинної форми інтерферону відмиванням буферним розчином з детергентами, розчиненні осаду інтерферону в розчині гуанидин гідрохлориду, ренатурації і одностадійної очищенню іонообмінній хроматографією. В якості продуцента використовують штам E.coli SS5, отриманий за допомогою рекомбінантної плазміди pSS5, містить три промотора: Plac, Pt7 і Ptrp, і ген альфа-інтерферону з введеними нуклеотидними замінами.
Експресія інтерферону штамом E.coli SS5, що містить цю плазміду, контролюється трьома промоторами: Plac, Pt7 і Ptrp. Рівень експресії інтерферону становить близько 800 мг на 1 л клітинної суспензії.
Недоліком способу є низька технологічність використання ферментативного руйнування клітин, ДНК і РНК мікроорганізму і одностадійна хроматографічна очистка інтерферону. Це обумовлює нестабільність процесу виділення інтерферону, призводить до зниження його якості і обмежує можливість використання наведеної схеми для промислового виробництва інтерферону.
Недоліками даної плазміди і штаму на її основі є використання в плазміді сильного нерегульованого промотора фага Т7 в штамі Е. coli BL21 (DE3), в якому ген Т7 РНК полімерази знаходиться під промотором lac оперона і який завжди "тече". Отже, в клітці безперервно відбувається синтез інтерферону, що призводить до дисоціації плазміди і зниження життєздатності клітин штаму, і в результаті - зниження виходу інтерферону.
Для отримання великих кількостей ІФН використовують шестиденні одношарові культури клітин курячого ембріона або культивовані лейкоцити крові людини, заражені певним видом вірусу. Іншими словами, для отримання ІФН створюють певну систему вірус-клітина.
З клітки людини ізольований ген, відповідальний за біосинтез ІФН. Екзогенний людський ІФН отримують, використовуючи технологію рекомбінантних ДНК. Процедура виділення кДНК ІФН-ів полягає в наступному:
1) З лейкоцитів людини виділяють мРНК, фракционируют її за розмірами, проводять зворотну транскрипцію, вбудовують в са...
