Асиметріямембран
Введення
Всібіологічні мембрани асиметричні, і легко зрозуміти чому: адже кожна з нихмає дві поверхні, омивані різними середовищами. В якості прикладу можнапривести плазматичну мембрану, звернену однією стороною в цитоплазму, аінший - в позаклітинний простір. Саме трансмембранная асиметрія, дифференцирующаядві половинки бішару, обумовлює чутливість мембрани до змінсередовища по обидві її сторони. Очевидно, що асиметрія мембранних білків залежить відспособу, яким той чи інший білок був впроваджений в мембрану. Швидкість В«фліп-флопаВ»білків у Біслі пренебрежимо мала. Мембранні ліпіди теж розташованіасиметрично. Найбільш переконливо це було показано для еритроцитів. Яквиникає ліпідна асиметрія і як вона підтримується - в даний час підчому неясно. В одних випадках важливу роль відіграють фізичні чинники, вЗокрема кривизна мембрани, в інших визначальний внесок вносять взаємодіїз цитоскелету або участь АТР-залежних ферментоподобних В«фліпазВ».
Ясно,що крім трансмембранного асиметрії мембран притаманна і латеральна негомогенності.Поверхнева мембрана багатьох еукаріотичних клітин сильно поляризована імає чітко виражені макроскопічні домени. В якості прикладу можнапривести базолатеральной і апікальну області плазматичної мембраниполяризованих епітеліальних клітин. Ці домени виконують різні функції,мають неоднаковий склад і фізично рознесені по поверхні клітини. Мембранитила-КОІД в хлоропластах також мають доменну структуру; зокрема, у нихє щільно прилягають один до одного мембранні ділянки та несопрікасающіесяобласті, що містять різні елементи системи електронного транспорту. Цідосить протяжні латеральні домени можуть існувати за рахунокспецифічних білок-білкових взаємодій між мембранами або можуть бути обумовленінаявністю в самій мембрані спеціальних структур, взаємодією з компонентамицитоскелету або агрегацією білків у площині мембрани. Деталі цихвзаємодій поки невідомі.
ЩоЩодо можливості існування малих ліпідних доменів в мембрані, тобтоокремих ділянок, у межах яких біс-лій має специфічні фізичнівластивості і склад, то говорити про це можна з меншою визначеністю. Вмодельних системах при різних умовах дійсно спостерігається латеральнеподіл фаз, і заманливо було б припустити, що подібний поділіснує і в біологічних мембранах при фізіологічних умовах. Можливо,це не-біслойной елементи мембрани або якісь перехідні структури.
Мирозглянемо асиметричний розподіл мембранних білків і ліпідів. У цілому всюцю область можна назвати мембранної топографією. Сюди ж відноситься і описцитоскелету, оскільки він, по-видимому, відіграє важливу роль в організації білківі, можливо, ліпідів в плазматичною мембрані еукаріот.
1.Топографія мембранних білків
Мембраннібілки вбудовані в бішар асиметрично, і ця асиметрія регулюєтьсякінетичними факторами. Енергія активації для такої переорієнтації білка вмембрані, коли полярні і заряджені залишки, які зазвичай перебувають наповерхні, хоча б тимчасово опиняються в гідрофобною області бішару, дужевелика. І хоча відомо, що деякі мембранні білки дифундують уздовжбішару та/або обертаються навколо осі, перпендикулярної його поверхні, немаєніяких даних про те, що якесь спонтанне переміщення може призвести дозміни транс-мембранної орієнтації білка по відношенню до двох сторінбішару.
Вцьому розділі подано огляд основних експериментальних підходів довизначенню трансмембранного орієнтації білків в бі-шарі. Є багато способів,дозволяють передбачити локалізацію спіралей, які пронизують мембрану, виходячи зпервинної послідовності даного білка. В одних випадках ці пророкуванняє досить чіткими і узгоджуються з результатами експериментальних досліджень,в інших однозначну відповідь отримати не вдається. Жодна модель, побудована здопомогою комп'ютера, не є остаточною, вона дає лише вихідну точку дляаналізу. Абсолютно ясно, що будь детальне дослідження інтегральногомембранного білка повинно включати експериментальне вивчення його топографії.Зробити це буває непросто, і часто для побудови адекватної моделідоводиться застосовувати кілька підходів, оскільки жоден метод не застрахованийвід помилок. Детального розгляду окремих експериментальних підходівприсвячені огляди.
1.1Методологія протеоліз
Використанняпротеаз для визначення топографії білків у ряді випадків виявилосявиключно плідним. Орієнтований мембранний препарат, що міститьдосліджуваний білок, обробляють протеолітичним ферментом і по місцяхрозщеплення встановлюють ті ділянки поліпептиду, які знаходяться з зовнішньоїбоку мембрани. Ключовим моментом є приготування мембран зоднозначної топологічної орієнтацією; тільки в цьому випадку можливаадекватна інтерпретація результатів фрагментації досліджуваного білка. Деякімембрани можна вивчати без попереднього виділення. Однак у більшостівипадків необхідна ретельна робота з отримання топологічноорієнтованого препарату з вивернутою мембраною або з мембраною, що маєнативну орієнтацію. Такі препарати були отримані для мембран еритроцитів,плазматичних мембран деяких еукаріотичних клітин, внутрішніхмітохондріальних мембран, мембран саркоплазматичного рети-Кулум і деякихбактеріальних мембран. В окремих випадках вдається досліджувати локалізаціюконкретного білка, спеціально вбудованого в орієнтовану мембрануреконструйованих протеоліпосом. У біологічних мембранах крім досліджуваногобілка найчастіше знаходяться і інші білки. Якщо досліджуваний білок переважає, топродукти протеолізу можна виділити і охарактеризувати. Якщо ж він ємінорним білковим компонентом, то для ідентифікації фрагментів доводитьсявикористовувати непрямі методи, пов'язані із застосуванням специфічних антитілабо хімічних реагентів з наступним електрофорезом в ПААГ у присутності ДСН.Важливо переконатися в тому, що ті ділянки білка, які недоступні длярозщеплення, не будуть піддаватися гідролізу через пошкодження мембран при первісномупротеолизе. Необхідно також швидко і оборотно інгібувати протея-зи,оскільки багато з цих ферментів залишаються активними навіть після додавання ДСНперед електрофорезом. Слід мати на увазі, що відсутність розщеплення щенічого не означає, оскільки можливі місця розщеплення на зовнішнійповерхні можуть виявитися недоступними для протеази через особливостітретинної структури мембранного білка.
Які у випадку багатьох розчинних білків, протеоліз не обов'язково супроводжуєтьсяістотними змінами в третинної або четвертинної структурі мембранногобілка in situ, хоча йогобіологічна функція може бути повністю втрачена. У тих випадках, коли прирозщепленні по одному або двом місцям активність зникає, за допомогою протеолізуможна ідентифікувати і навіть виділити функціонально важливі домени білка.
ВЯк приклади, що ілюструють використання протеолі-тичні ферментів,можна привести білок смуги 3 еритроцитів, бактеріородопсин, лактозопермеазу Е. coli і субодиницю IV цитохром с-оксидази.
Імунологічніметоди
Дужецінним інструментом для визначення топографії мембранних білків єспецифічні антитіла. У цьому випадку досліджують зв'язування антитіл з білкамитільки в орієнтованих мембранних препаратах типу мембранних везикул Е. coli. Аналізможна зробити кількісним, якщо використовувати відповідніімунологічні методи. Місця зв'язування можна локалізувати за допомогоюелектронної мікроскопії, помітивши антитіла колоїдним золотом або використовуючизолото, пов'язане зі специфічним комплексом антиген-антитіло на поверхнімембрани. Ясно, що в процесі приготування мембранного препарату не повинніруйнуватися нативні топографічні структури. Чим точніше дані про місцязв'язування антитіл, тим інформативніше будуть ці експерименти. Якщо досліджуватиорієнтовані мембрани з нормальною або вивернутою орієнтацією, то за допомогоюполі-клональних антитіл проти певного очищеного поліпептидногофрагмента можна визначити, чи має досліджуваний білок ділянки, експоновані нанебудь одній стороні мембрани. Однак такі експерименти не дозволяютьвизначити, яка ча...
