РЕФЕРАТ
Імунологічні методи
2009
ВСТУП
В імунології застосовується цілий ряд експериментальних методів з інших областей біології. Так, виділення антигенів та антитіл виробляють за допомогою біохімічних методів фракціонування білків, гени імунологічно важливих молекул секвеніруют звичайними молекулярно-генетичними методами. Разом з тим в імунології розроблені і свої спеціальні методи дослідження, засновані на взаємодії антиген-антитіло. Ці імунологічні методи в свою чергу знайшли застосування в різних областях біології. Зокрема, будь-які молекули, що володіють антигенними властивостями, можна виявляти в тканинах імуногістохімічними методами. Для кількісного визначення таких молекул, присутніх в надзвичайно низьких концентраціях, застосовують радіоіммуноаналіз і ферментний іммуносорбентний аналіз. В даний час існують сотні різноманітних імунологічних методів: найбільш широко застосовувані з них описані в цій роботі.
взаємодія антиген-антитіло
Реакція преципітації. Одним з перших описаних проявів взаємодії антиген-антитіло було утворення преципітату при змішуванні обох реагентів в еквівалентних або близьких до еквівалентних кількостях. Воно спостерігається при постановці класичної реакції преципітації з розчинними антигенами і антитілами. Якщо проводити цю реакцію в агаровому гелі, можна диференціювати окремі реакції антиген-антитіло, зумовлені різними популяціями антитіл, присутніми в сироватці. Такий метод, названий методом подвійного іммунодіффузіі, застосовується також для перевірки схожості між різними антигенами.
Однак деякі суміші антигенів занадто складні для поділу просто шляхом дифузії і преципітації, і для аналізу таких сумішей був розроблений метод іммуноелектрофореза - перш ніж виявляти антигени візуально в реакції преципітації, їх розділяють по заряду за допомогою цього методу.
Методи, засновані на дифузії в гелі, дозволяють визначати антигени і антитіла лише якісно, ​​кількісну ж оцінку реагуючих компонентів проводять розробленим пізніше методом простої радіальної іммунодіффузіі.
іммунодіффузіі в електричному полі можна виробляти з одночасним зустрічним рухом антигенів і антитіл; цей спосіб названий зустрічним електрофорезом. Аналогічна модифікація простої радіальної іммунодіффузіі отримала назву ракетний електрофорез.
Описані методи використовуються для визначення антигенів і антитіл у концентрації від 20 м кг/мл до 2 мг/мл.
Реакції гемаглютинації та зв'язування комплементу
Якщо антитіла присутні в таких низьких концентраціях, що їх не вдається виявити і кількісно визначити за допомогою зустрічного і ракетного електрофорезу, застосовують реакцію гемаглютинації. Вона заснована на здатності антитіл перехресно зв'язуватися з еритроцитами, взаємодіючи з їх поверхневими антигенами.
Реакція антиген-антитіло веде до утворення імунних комплексів, які пов'язують комплемент при його активації за класичним шляху, і на цьому заснований один з кількісних методів визначення антигенів і антитіл. За допомогою реакцій гемаглютинації і зв'язування комплементу вдається виявляти антитіла, присутні в концентрації <1 мкг/мл.
Пряма і непряма імунофлуоресценція
імунофлуоресцентного методи широко використовуються для виявлення аутоантитіл і антитіл до тканинних і клітинних антигенів. Хоча ці методи технічно більш складні, ніж описані вище, вони мають явну перевага в тих випадках, коли потрібно визначити число видів антитіл. Використовуючи зрізи тканин, на одному предметному склі можна виявити антитіла до декільком різним антигенів, встановивши при цьому їх внутрішньотканинний або внутрішньоклітинне розподіл.
Крім того, за допомогою імунофлуоресцентного тестів можна ідентифікувати окремі клітини в клітинній суспензії, тобто виявляти антигени на поверхні живих клітин. Для цієї мети суспензію живих клітин, флуоресцентно забарвлених специфічними реагентами, пропускають через проточний флуоресцентний клітинний сортер - прилад, що вимірює інтенсивність світіння кожної клітини в різних областях спектру і потім розділяє клітини по параметрами світіння. Даний метод дозволяє виділяти різні клітинні популяції, тобто розділяти клітини, що несуть специфічні поверхневі антигени і відповідно до цього забарвлені різними флуоресцентно міченими антитілами.
Імунологічний аналіз антигенів і антитіл за допомогою мічених реагентів
Методи цієї категорії відрізняються дуже високою чутливістю і економічністю у витраті реагентів. Найбільш поширений з усіх імунологічних методів - це, ймовірно, іммуносорбентний аналіз антитіл із застосуванням лігандів, мічених радіоізотопами або ферментами; він дозволяє досліджувати велике число зразків у відносно короткий час. Кількість антигену можна вимірювати за допомогою методу В«подвійний антигенної пастки В»або конкурентного іммуноаналі-за із застосуванням будь-якого маркера для визначення.
иммуноблоттинга і іммунопреціпітація
Описані вище методи зазвичай застосовують для визначення рівня конкретних відомих антигенів і антитіл, однак часто необхідно ідентифікувати та охарактеризувати не відомі заздалегідь антигени, що містяться в багатокомпонентної суміші. Для цієї мети особливо підходить імуноблотінгу.
При проведенні імуноблотінгу складну суміш антигенів спочатку піддають гель-електрофорез, а потім фракціоновані пептиди переносять на лист нітроцелюлози для ідентифікації індивідуальних антигенів при допомогою специфічних антисироваток. Виробляючи попереднє розділення в гелі з додецилсульфату натрію або в гелі для ізо-електричного фокусування можна отримати дані про розміри і ізоелектричної точці досліджуваних антигенів, а також про подібність між ними.
У деяких випадках в результаті електрофорезу в гелі і процедури блоттинга антиген денатурує так, що деякі з його епітопів руйнуються і втрачають здатність зв'язуватися зі специфічними антитілами. В такій ситуації замість блоттинга слід використовувати іммунопреціпітаціі, щоб встановити, який антиген пов'язують антитіла. Даний метод може бути застосований для визначення як розчинних, так і мембранних антигенів.
ОТРИМАННЯ ЧИСТИХ АНТИТІЛ
В імунологічних дослідженнях часто виникає необхідність в отриманні очищених препаратів антитіл, тобто антігенспеціфічних або неспецифічних імуноглобулінів. Виділення неспецифічних імуноглобулінів з сироватки зазвичай проводять шляхом послідовного фракціонування білків, яке включає наступні етапи.
• Осадження гамма-глобулінів в 30-50% розчині сульфату амонію.
• Гель-фільтрація для отримання молекул відповідних розмірів.
• Іонообмінна хроматографія з метою виділення молекул, несучих сумарний позитивний заряд при нейтральному рН.
• афінної хроматографії з використанням природних лігандів імуноглобулінів, наприклад стафілококового білка А.
Виділення антігенспеціфічних імуноглобулінів здійснюють методом афінної хроматографії. Антиген В«пришиваютьВ» до частинок сефароза і Зв'язатися з ним В«чистіВ» антитіла елюіруют з Імуносорбент хаотропнимі агентами або буферним розчином. Метод афінної хроматографії застосовують і для отримання очищених препаратів антигенів.
Отримання моноклональних антитіл
Іншим способом отримання індивідуальних антитіл певної специфічності служить гібридомної технології - створення імморталі-зовано лінії клітин, що продукують антитіла тільки однієї специфічності, тобто моноклональні. У такій культурі можна підтримувати антитілоутворення невизначено довгий час. Моноклональні антитіла незрівнянно краще відповідають цілям імуноаналізу, ніж гетерогенні сироватки, одержувані від імунних тварин, і тому знайшли широке застосування в різних областях біології в якості високоспецифічних зондів.
Ефективно продукувати моноклональні антитіла можу...
