Кінетика дії ферментів
Кінетичнідослідження ферментативних реакцій необхідні не тільки для кількісноговизначення ферментів і порівняння швидкостей їх функціонування, але, в щебільшою мірою, для розшифровки механізмів ферментативних реакцій. У цихцілях, перш за все, необхідно вміти коректно обчислювати кінетичні параметриферментативних реакцій, оцінювати конкурентний або неконкурентний характердії інгібіторів. Розглянемо основні рівняння, що описують ферментативнукінетику і способи обчислень. Основна увага буде приділена не строгостіматематичного виведення рівнянь, а правильному їх використанню для отриманнядостовірних результатів.
Прививеденні кінетичних рівнянь кількісно характеризують ферментативнуактивність, зазвичай роблять такі припущення.
1.Фермент і субстрат утворюють фермент-субстратної комплекс за рахунок сил фізичноїприроди. З цього комплексу в подальшому звільняютьсяфермент і продукт. Таким чином, хімічною реакцією єтільки другий етап - розпад фермент-субстратного комплексу:
2.Концентрація субстрату звичайно значно вище концентрації ферменту. Томупри розгляді початкових швидкостейреакції, коли
3.Константа дисоціації визначається співвідношенням:
концентраціяпродукту дуже низька, оборотністю другій стадії можна знехтувати.Отже, - const.,а швидкість утворення продукту дорівнює:
Оскількизагальна концентрація ферменту дорівнює сумі концентрацій вільного ферменту іферменту, зв'язаного в комплекс, то + або = -.
Підставляючи значення [Е]= [Е 0 ] - [ES] з (4),отримуємо:
Зіншого боку, з рівняння слід:
Врівнянні вираз до +2 можна розглядати як максимальнушвидкість, що досягається, коли концентрація фермент-субстратногокомплексу чисельно дорівнює загальній концентрації ферменту. Отже:
-->p>
Виразє не що інше, як рівняння Міхаеліса-Ментен для ферментативної кінетики, авеличина К га = K s являє собою міру спорідненості ферменту досубстрату. Чисельно вона дорівнює такої концентраціїсубстрату, при якій початкова швидкість ферментативноїреакції складає половину максимальноїшвидкості. Рівняння графічно виражається гіперболою.
Дляпрактичного визначення кінетичних параметрів цей графік незручний, до тогож вимагає використання концентрацій субстрату, В«насичуютьВ» фермент, що незавжди досяжно при обмеженій розчинності субстрату. Тому зазвичайпрагнуть перетворити рівняння Міхаеліса-Ментен в таку форму, щобграфічно воно зображувалося прямою лінією. Найчастіше для цього використовуютьметод Лайнуівера-Берка, представляючи рівняння Міхаеліса-Ментен у вигляді рівнянняпрямої лінії:
Останнєвираз називають рівнянням Лайнуівера-Берка і для розрахунку кінетичнихпараметрів використовують графік, побудований в координатах: 1/V проти 1/S. У результаті виходить пряма,отсекающая на осі ординат відрізок, рівний 1/V, а на продовженні осі абсцис відрізок,рівний - 1/К га . Однак слід зазначити, що при використанніграфіка Лайнуівера-Берка точки в області високих концентрацій субстратурозташовуються дуже густо, а положення прямої лінії в чому залежить відточок в області низьких концентрацій субстрату, де визначення швидкості меншнадійно. Крім того, реальні експериментальні дані не завжди адекватноапроксимуються у вигляді прямої лінії.
Томузапропоновано ще декілька прийомів для визначення кінетичних параметрів. МетодЕді-Хофсті також заснований на перетворенні рівняння Міхаеліса-Ментен. Помножившиобидві частини рівняння на і перетворивши, одержимо:
Графікцього рівняння в координатах V проти V/S являє собою пряму лінію,відсікає на осях ординат і абсцис відрізки, рівні V max HV m > x /До го відповідно.
Вдеяких випадках для обчислення кінетичних параметрів зручніше використовуватиметод Ейзенталя і Корніш-Боуден, заснований на перетвореному рівнянніМіхаеліса-Ментен:
Вцьому випадку для кожного значення V і Sбудується пряма в координатах V і S.Точка перетину всіх цих прямих має координати: V max іДо т .
Інгібування ферментів
Вивчення придушенняактивності ферментів служить одним із способів розшифровки механізму їхдії. Підходом до вирішення останнього завдання є вивчення специфічностідії ферментів. У свою чергу, це вимагає коректного вимірюваннякінетичних параметрів у присутності досліджуваного аналога субстрату. Розглянемоспособи визначення характеру взаємовідносин субстратів, їханалогів та інгібіторів ферментативної активності шляхом обчислення рядукінетичних параметрів.
Прицьому, якщо константа дисоціації комплексу K s = K m дорівнює:
Інгібіториферментів можна розділити на дві основні групи: оборотніі незворотні. Післявидалення інгібітора першого типу активність ферменту відновлюється; піддругому випадку інгібітор видалити не вдається або активність ферменту невідновлюється навіть після видалення інгібітора. Необоротне інгібуваннядосягає максимуму, коли весь фермент пов'язаний з інгібітором. Оборотнеінгібування досягає стану рівноваги, положення якого визначається константоюінгібування, що характеризує спорідненість ферменту до інгібітору.Схема оборотного інгібування наведена нижче:
Приконкурентному інгібуванні субстрат і інгібітор зв'язуються з одним і тим жеактивним центром ферменту. У присутності інгібітора знижується спорідненість ферментудо субстрату. Величина не змінюється, так як при В«насичуєВ» концентраціїсубстрат витісняє інгібітор з комплексу з ферментом.
Принеконкурентном інгібуванні субстраті інгібітор зв'язуються з різними центрами ферменту. При цьому величина К га не змінюється, а величина V max знижується.
Можливітакож проміжні або альтернативні випадки, наприклад, коли інгібіторпов'язується не з ферментом, а з фермент-субстратного комплексу, як у випадку безконкурентногоінгібування, при якому змінюються обидва кінетичнихпараметра.
Длявизначення типу інгібування зазвичай використовують графік Лайнуівера-Берка,отриманий для даного субстрату в відсутність і в присутності інгібітора.
Приконкурентному інгібуванні, якщо визначена величина К т вприсутності інгібітора, можна розрахувати константу інгібування за наступноюформулою:
Принеконкурентном інгібуванні за допомогою визначення зміненої величини V можнарозрахувати К. за наступною формулою:
Всі біохімічніпроцеси в клітині взаємопов'язані і взаємозалежні, проте частина з нихпереважно виконує функцію побудови клітинного матеріалу, а частина - постачанняджерелами енергії цих В«будівельних робітВ». Тому прийнято розділятибіохімічні процеси на два основних типи: асиміляційні,званіанаболизмом, що включає синтез низькомолекулярнихпопередників і побудови з них молекул біополімерів, і Дисиміляційна,званікатаболізмом, що складається в забезпечення джерела енергії,В«Енергетичного приводуВ», який приводить в рух анаболізм.
Розглянемо основнімеханізми процесів трансформації енергії в клітині, тобто механізмикатаболічних процесів.
Шляхиі механізми перетворення енергії в живих системах
Головназавдання енергетичного метаболізму - акумуляціяенергії, отриманої в результаті окисно-відновних перетвореньсубстратів в таку форму, яка може бути використана для росту клітин іздійснення всіх їх функцій.
Основнимиформами акумуляції енергії в клітинах є трансмембраннаярізниця електрохімічних потенціалів іонів,а також В«макроергічніВ» хімічні сполуки.
Вклітинах, як і в неживих системах, мимовільно протікають тільки ті хімічніпроцеси, які призводять до зменшення вільноїенергії системи, тобто тієї частки загальної енергії, якаможе бути перетворена в роботу. Такі ре...
