Конструювання, клонування і відбір рекомбінантних молекул ДНК
Розглянемо процес отримання клонованих ДНК. На першомуетапі готують фрагменти ДНК, придатні для подальшого лігування з векторноюмолекулою. Наступний етап полягає в самому лигирование. Ці процесиздійснюються in vitro. Далі рекомбінантні молекули вводять в клітини, де вониампліфіціруются шляхом реплікації. Потім проводять клонування, відбір таподальшу ампліфікації.
Вставки
а. Загальні положення
При конструюванні рекомбінантних молекул зазвичай використовуютьскладні суміші потенційних вставок, і в результаті утворюється цілий набірклонів, з якого шляхом скринінгу і відбору отримують потрібні рекомбінантнімолекули. Скринінг і відбір можна значно спростити, якщо збагатити вихіднусуміш потрібним сегментом; в цьому випадку для виявлення шуканого рекомбінантовдоводиться перевіряти значно менше рекомбінантних клонів. З одного боку,для конструювання рекомбінантних ДНК можна використовувати очищені фрагментиДНК, а з іншого - саме молекулярне клонування є найбільш простим і ефективнимспособом очищення фрагментів. Клонування являє собою також найбільшефективний спосіб отримання більшості фрагментів геномної ДНК в значнихкількостях.
Існує три джерела вставок для клонування:
1) геномна ДНК, фрагментована або за допомогоюрестріктірующіх ендонуклеаз, або фізичними методами, наприклад за допомогоюультразвуку;
2) синтетичні фрагменти ДНК, отримані хімічним абоферментативним методом або шляхом об'єднання цих двох методів;
3) сегменти ДНК, отримані за допомогою ферментативногокопіювання РНК-матриці in vitro. При розщепленні ДНК ендонуклеазами часто утворюютьсяфрагменти, здатні до безпосереднього лигированию з підходящими липкими аботупими кінцями вектора. В інших випадках відповідні кінці приєднують дофрагментам перед лігування.
б. Вставки геномної ДНК
Ендонуклеазное розщеплення. Найбільш прямий спосіб отриманнявставок полягає в розщепленні сумарною геномної ДНК-якого організму чивірусу за допомогою рестріктірующей ендонуклеази. Метод відрізняється високоювідтворюваністю: специфічний фермент розрізає дану ДНК з утвореннямунікального набору фрагментів. Якщо при ендонуклеазном розщепленні утворюютьсялипкі кінці, відповідні кінців векторної молекули, то клонуванняздійснюють відразу або після збагачення популяції фрагментами для отриманняпотрібної вставки.
Збагачення суміші потрібними фрагментами. Для ефективногорозділення складних сумішей фрагментів використовують два методи: електрофорез внапіврідкої середовищі і рідинну хроматографію високого дозволу з зверненоїфазою. Проте жоден з цих методів не дозволяє отримати фрагменти в чистомувигляді. Зазвичай препарати містять домішки інших фрагментів, що мають близькудовжину або володіють такою ж здатністю до елюціі. Тим не менше можнаотримати значне збагачення суміші в відношенні потрібного фрагмента, щополегшує його виявлення у великій колекції клонів.
При електрофорезі та хроматографії розділення фрагментів ДНКгрунтується на їх відмінності за розміром і нуклеотидного складу. Якщо розміргеному невеликий, то утворюється відносно невелике число добре разделяющихсяфрагментів; їх легко виділити, зібравши потрібні фракції елюату зхроматографічної колонки або вирізавши шматочки агарозного гелю. Однак якщорозщеплюється великий геном, то добре відділяються лише деякі фрагменти. Частішевиходить безперервний набір фрагментів всіляких розмірів. Щоб зрозуміти, вчому тут справа, проведемо простий розрахунок. Типовий гаплоїдний геном ссавцівмістить приблизно 3 * 10 9 п. н. Грубу оцінку числа фрагментів,утворюються при вичерпному розщепленні ендонуклеази, можна отримати,розділивши розмір генома на передбачуване середня відстань між двомасусідніми сайтами для даної рестріктірующей ендонуклеази. Для ферменту,Дізнатися ділянку з шести пар основ, середня відстань між сайтамибуде дорівнює 4 6 п. н. Якщо розмір сайту впізнавання дорівнює чотирьом парамнуклеотидів, то він буде зустрічатися приблизно один раз на кожні 4 4 п.н. При розщепленні ДНК ссавців ферментами, які розрізають молекулу посайтам впізнавання завдовжки шість пар нуклеотидів, утворюється приблизно 7 * 10 5 унікальних фрагментів, а ферментом, сайт впізнавання якого становить чотирипари нуклеотидів, - 12 * 10 6 фрагментів. У результаті виходитьбезперервне розподіл фрагментів по довжинах. При цьому деякі фрагментивзагалі неможливо виявити, оскільки вони представлені в дуже малій кількості.
Ідентифікація специфічних фрагментів. Проблеми,виникають при ідентифікації фрагментів. При розщепленні приблизно 50 мкггеномної ДНК і наступному електрофорезі препарату маса сегмента ДНК довжиною1000 п. н., Що зустрічається в геномі лише один раз, становить всього 17 * 10 -6 мкг, або 17 пг. Як ідентифікувати цей специфічний фрагмент? Якщо маєтьсягомологичная ДНК або препарат комплементарної РНК, які можна використовувати вЯк зонда при гібридизації, то нас цікавить фрагмент можна виявитипри відпалі зонда з фрагментами після їх денатурації. Так, в якості зондаможна використовувати очищену мРНК, відповідну гену, який ми хочемоклонувати. Іноді в ролі зонда виступає гомологічний ген, клонований віншому організмі і має досить близьку структуру. Щоб виявити гібрид,потрібно використовувати мічений зонд. Найчастіше його мітять радіоактивним ізотопом.
Визначивши зразковий розмір даного нас фрагмента,можна елюіровать матеріал відповідної галузі іншого гелю, який не пройшовгібридизацію, і використовувати цей матеріал для клонування. Аналогічнимчином можна тестувати фракції після хроматографічного розділенняфрагментів на колонці.
блоттинга. Майже у всіх випадках, подібних описаним вище,ДНК перед гібридизацією переносять з гелю на більш відповідну підкладку. Цейметод широко використовується, наприклад, для ідентифікації специфічних РНК ібілків після їх електрофоретичного розділення. Блот ДНК названий по іменійого винахідника блоттинга по Саузерн; відповідні методики для РНК ібілків отримали назву Нозерн-блот і вестерн-блот.
Гібридизація міченого зонда з фрагментами ДНК, що знаходятьсяв гелі, відбувається дуже неефективно. Тому перед відпалом фрагментипереносять з гелю на більш відповідну тверду підкладку, зазвичай нанітроцелюлозні фільтр або нейлон. Спочатку гель обробляють лугом, щобвідбулася денатурація ДНК. Потім на нього накладають тверду підкладку іпропускають через гель буферний розчин. В результаті фрагменти ДНК переходять напідкладку із збереженням їх взаємного розташування. Далі інкубують підкладку врозчині, що містить 32 Р-зонд, при такій іонній силі і температурі,які забезпечують утворення водневих зв'язків між зондом ікомплементарним фрагментом ДНК. Чутливість методу залежить від питомоїрадіоактивності зонда і дозволяє зареєструвати фрагменти, коли їх кількістьвимірюється пикограмм. Наприклад, 32 Р-мічені зонди, отримані здопомогою нік-трансляції, мають питому радіоактивність більше 100 імп./Хв на 1пг, що достатньо для візуалізації Радіоавтографія.
Випадкова фрагментація геномної ДНК. Довгі молекули ДНКлегко ламаються навіть при незначних гідродинамічних напругах, і їхможна піддати випадкової фрагментації за допомогою ультразвуку, шляхом швидкогоперемішування розчину або пропускання його через невеликий отвір. Дляотримання випадкового набору перекриваються фрагментів можна використовувати ірестріктірующіе ендонуклеази, якщо проводити досвід в таких умовах, колирозщеплення відбувається лише в невеликому числі наявних сайтів. Середній розмірутворюються фрагментів залежить від величини прикладається зусилля і відконцентрації ендонуклеази. Зазвичай ДНК виділяють з великою популяції клітин,тому вихідні її препарати завжди представлені великим числом ідентичнихгеномів. Кожен сегмент ДНК присутня в кінцевому наборі у фрагментах різнихрозмірів, що не дозволяє очистити й...
