Реферат з біотехнології
"Рекомбінантнібілки (властивості плазмід, отримання) "
Введення
Генетичнаінженерія конкретніше і точніше клітинної по характеристиці використовуваних об'єктіві оперує в основному з різними за формою і розмірами фрагментами клітини. ТермВ«Генетична інженеріяВ», В«генна інженеріяВ» та В«рекомбінантна ДНКВ» -рівноцінні [3].
Генетичнуінженерію можна представити як з'єднання фрагментів ДНК природного ісинтетичного походження чи комбінацію in vitro з наступним введеннямотриманих рекомбінантних структур в живу клітину для того, щоб введенийфрагмент ДНК після включення його в хромосому або реплікуватись, абоавтономно експресуватися.
Успіхигенетичної інженерії призвели до того, що понад 100 білків людини(Біорегуляторів, коректорів гомеостазу, факторів вродженого і набутогоімунітету) можуть зберігати свою відеоспеціфічность. Вони напрацьовуються яклікарські засоби шляхом мікробтологіческого синтезу. При цьому технологіярекомбінантної ДНК дозволяє їх удосконалювати: підвищувати фізіологічнуактивність, знижувати ймовірність побічних реакцій після введення і так далі.
Основним приотриманні рекомбінантних білків є вирішення проблеми дефіциту сировини, такяк з людських тканин в промисловому масштабі отримувати їх неможливо.
В якостіпродуцентів рекомбінантних білків людини частіше за інших в даний часвикористовуються: E.coli (кишкова паличка), Bacillus subtilis (сінна паличка), Saccharomyces cerevisiae (пекарські дріжджі).
Ці організмидосить безпечні, однак потрапляння їх у навколишнє середовище з ряду причиннебажано. У зв'язку з цим існує прийняті і ретельно дотримуваніправила роботи з рекомбінантов.
Безпекаповинна дотримуватися на генетичному і на фізичному рівні і це відноситься довиробництва будь-яких рекомбінантних білків.
1. Методигенної інженерії при отриманні рекомбінантних білків
Генетичнаінженерія - конструювання in vitro функціонально активних генетичнихструктур (рекомбінантних ДНК), або інакше - створення штучних генетичнихпрограм (Баєв А.А.). За Е.С. Пірузян генетична інженерія -система експериментальних прийомів, що дозволяють конструювати лабораторнимшляхом (у пробірці) штучні генетичні структури у вигляді так званихрекомбінантних або гібридних молекул ДНК.
Генетичнаінженерія - отримання нових комбінацій генетичного матеріалу шляхом проведенихпоза клітини маніпуляцій з молекулами нуклеїнових кислот і перенесення створенихконструкцій генів в живий організм, в результаті якого досягається їхвключення і активність у цьому організмі і у його потомства. Мова йде пронаправленому, за заздалегідь заданою програмою конструюванні молекулярнихгенетичних систем поза організмом з наступним введенням їх в живий організм.При цьому рекомбінантні ДНК стають складовою частиною генетичного апаратурецепіентного організму і повідомляють йому нові унікальні генетичні, біохімічні,а потім і фізіологічні властивості.
Метаприкладної генетичної інженерії полягає в конструюванні такихрекомбінантних молекул ДНК, які при впровадженні в генетичний апаратнадавали б організму властивості, корисні для людини. Наприклад, отриманняВ«Біологічних реакторівВ» - мікроорганізмів, рослин і тварин, які продукуютьфармакологічно значущі для людини речовини, створення сортів рослин іпорід тварин з певними цінними для людини ознаками. Методи генноїінженерії дозволяють провести генетичну паспортизацію, діагностуватигенетичні захворювання, створювати ДНК-вакцини, проводити генотерапіюрізних захворювань [1].
Технологіярекомбінантних ДНК використовує наступні методи:
- специфічнерозщеплення ДНК рестріцірующімі нуклеазами, ускоряющее виділення і маніпуляціїз окремими генами;
- швидкесеквенування всіх нуклеотидів очищеному фрагменті ДНК, що дозволяєвизначити межі гена і амінокислотну послідовність, кодованих їм;
- конструюваннярекомбінантної ДНК;
- гібридизаціянуклеїнових кислот, що дозволяє виявляти специфічні послідовності РНКабо ДНК з більшою точністю і чутливістю, засновану на їх здатностіпов'язувати комплементарні послідовності нуклеїнових кислот;
- клонуванняДНК: ампліфікація in vitro за допомогою ланцюгової полімеразної реакції або введенняфрагмента ДНК в бактеріальну клітину, яка після такої трансформаціївідтворює цей фрагмент у мільйонах копій;
- введеннярекомбінантної ДНК в клітини або організми.
Конструюваннярекомбінантних молекул здійснюється за допомогою ряду ферментів - перш за всеферментів рестрикції. В даний час використовується понад 400 різнихрестриктаз. Ці ферменти синтезують найрізноманітніші мікроорганізми [5].
рестриктаздізнаються і розщеплюють специфічні нуклеотидні послідовності вдволанцюжкової молекулі ДНК. Однак одних ферментів рестрикції при молекулярномуклонуванні недостатньо, так як водневі зв'язки між чотирма підставами,які утворюють липкі кінці, не настільки міцні, щоб утримати дваоб'єдналися фрагмента ДНК.
Одна частинарекомбінантної молекули ДНК несе потрібний ген, який передбачаєтьсяклонувати, інша - містить інформацію, необхідну для реплікації в клітинірекомбінантної ДНК.
2. Плазміди. Поняття і типи плазмід
Найбільшпоширеним методом генної інженерії є метод отриманнярекомбінантних (що містять чужорідний ген) плазмід, які являють собоюкільцеві, дволанцюжкові молекули ДНК, що складаються з декількох пар нуклеотидіві здатнідо автономної реплікації [4].
Для плазмідхарактерно стабільне існування в нехромосомной стані в бактеріях. Кожна бактерія крімосновний, не покидає клітку молекули ДНК (5 * 106 пар нуклеотидів), можемістити кілька різних плазмід, якими вона обмінюється з іншимибактеріями.
Плазміди,розміри яких варіюють від кількох тисяч до сотень тисяч пар основ, ачисло копій на клітину - від однієї до кількох сотень, здатні до автономної(Незалежної від основної хромосоми) реплікації і стабільно успадковуються в рядуклітинних поколінь.
Хоча багатоплазміди дають клітинам-господарям відчутні селективні переваги (стійкістьдо антибіотиків, важких металів тощо), більшість з них є кріптіческой,тобто не проявляються у фенотипі клітин.
Областьпочатку реплікації невеликий плазміди ColE1, несучої гени стійкості доколіціни, традиційно використовується в генній інженерії при конструюваннівекторних молекул ДНК, які знаходять застосування для клонування та експресіїв клітинах E. coli коротких послідовностей нуклеотидів.
Плазмідивиявлені у багатьох бактерій, що належать до різних таксономічних груп.Кількість плазмідної ДНК у клітині становить зазвичай не більше кількохвідсотків від клітинного геному, а число плазмід коливається від 1 до 38. Плазміди- Це лінійні або кільцеві ковалентно замкнуті молекули ДНК, що містять від1500 до 40000 пар нуклеотидів. Більшість плазмід складається із трьох груп генів:ділянки ДНК, відповідального за автономну реплікацію плазміди в клітині; системигенів, що забезпечують можливість перенесення плазмід із однієї клітини в іншу;генів, що визначають властивості, корисні для клітини-хазяїна. Відмітнаособливість плазмід - здатність до автономної реплікації, тому мінімальнекількість ДНК, що може бути названо плазміди, - це фрагмент,забезпечує автономну реплікацію плазмідної ДНК у клітині як єдиногоцілого.
Зазвичай проприсутності плазмід в бактеріальній клітині судять по прояву певних ознак,до яких відноситься стійкість до окремих лікарських препаратів,здатність до переносу генів при кон'югації, синтез речовин антибіотичноїприроди, здатність використовувати деякі цукру або забезпечувати деградаціюряду речовин.
Більшістьбактеріальних плазмід володіє здатністю автономно реплікуватись, маєфактор несумісності і фактор переносу. Плазміди несуть безліч спеціальних,детермініруемих кожної окремої плазмидой маркерів: стійкість доантибіотиків, важки...
