1. Рекомбінантні(Химерні) ДНК
Створювані геннимиінженерами рекомбінантні ДНК називають химерними. Вони були створені для самихрізноманітних цілей, в тому числі і для целенаправленого впливу на ВІЛ. ВОстанніми роками число наукових робіт в цьому напрямку дуже велике. Одна з випробуваних схем з використанням химерних ДНКполягала в наступному. До гену, кодує білок-рецептор CD4, "підшили" інший ген, якийзабезпечує синтез рослинного білка рицину. Рицинще в середні століття використовувався як сильної отрути. Потрапляючи в клітину,він блокує синтез білка в цитоплазмі, тим самим вбиваючи її. Після внесення вклітини такий рекомбінантної ДНК в кінцевому підсумку відбувається утвореннякодованого їй химерного білка. Та його частина, яка відповідаєбілку-рецептору, забезпечує строго специфічне зв'язування химери з клітинами,на поверхні яких міститься вірусний білок CD4. Інша ж являєсобою отрута рицин і знищує клітини, з якими зв'язується химерна молекула.Таким чином, одна частина химери забезпечує спрямований пошук в організміклітин, заражених вірусом, а інша її частина вбиває їх. Схема досить простаі ефективна. В якості "вбивці" можна використовувати не тільки генрицину, але й деякі інші гени.
Інший підхід до боротьби зВІЛ-інфекцією заснований на здатності деяких вірусних білків (Tat і Rev), надзвичайно важливихдля розмноження ВІЛ в клітинах, специфічно зв'язуватися з певнимиділянками молекули вірусної РНК. Для того, щоб запобігти цей життєвоважливий процес, було запропоновано вводити в інфіковані клітини штучносинтезовані РНК, що містять ділянки зв'язування з вірусними білками.Вірусного білку все одно, з чим зв'язуватися - з вірусної РНК або точно такийж "копією", сконструйованої мистецтва. Додана в клітку ввеликій кількості, "копія" грає в даному випадку роль"Пастки": якщо її багато, білок вірусу буде зв'язуватисяпереважно з нею, а не з РНК вірусу, і, в результаті цього, ВІЛ перестанерозмножуватися.
Теоретично описаніпідходи виглядають дуже привабливо. І, як показали проведені випробування, візольованих клітинах вони працюють дуже добре. Однак немає надійних способівдоставки і забезпечення довгого функціонування химерних"Конструктів" в цілому організмі.
Зазначені труднощівчені намагаються подолати за допомогою тих же вірусів. Недавно опублікованоповідомлення про успішне використання для протидії ВІЛ вірусу сказу.Природно, це був не вірус сам по собі, а його варіант, який не здатнийприводити до захворювання. До такого варіанту був "пришитий" ген білкаCD4. В іншому схема була та ж, що і у випадку з рицином. Зв'язуючись тількиз ВІЛ-інфікованими клітинами, рекомбінантний вірус їх знищував, інші жклітини залишалися незмінними. Можливо, такий шлях виявиться ефективним вмайбутньому.
Нещодавно з'явилосяповідомлення про створення ще однієї "химери" проти ВІЛ на основіантиретровірусного препарату енфервіртід.
Енфервіртідявляє собою короткий фрагмент білка gp41 ВІЛ,який, незважаючи на те, що він ніби як "рідний", перешкоджаєвірусу "зливатися" з клітиною. На основі ретровірусу мишейсконструювали химерний вірус, який здатний в клітинах людини вироблятитакий короткий фрагмент білка ВІЛ і "виставляти" його на поверхніклітин, заражених химерним вірусом. В результаті ВІЛ не може проникати вклітки навіть за наявності в них усіх рецепторів і корецепторів. Таким чином,фрагмент вірусного білка виступає в якості "щита" проти цілоговірусу. Дуже важливо, що захист спрацьовує на самому початковому етапіінфікування клітини. Адже коли вірус вже проник в неї, з ним боротисяпрактично неможливо. Розпочаті в клініці випробування нової "химери",за твердженням дослідників, дали дуже обнадійливі результати.
2. Конструюваннярекомбінантних ДНК
Під рекомбінантнимирозуміють ДНК, утворені об'єднанням in vitro (у пробірці) двох або більшефрагментів ДНК, виділених з різних біологічних джерел. Ключовими вцьому визначенні є слова "фрагмент ДНК" і "об'єднання invitro ", що вказує на сутність генетичної інженерії та її відмінність відвсіх інших методів отримання гібридних (або химерних) організмів, таких якгенетична селекція, ембріональна інженерія і т.д.
Фрагменти ДНК, у томучислі і фрагменти, що містять гени, отримують з використанням ферментіврестриктаз. Рестріктази можуть утворювати фрагменти як з тупими, так і злипкими кінцями. Зшивання фрагментів ДНК проводиться трьома основними методами,залежними від того, які кінці мають фрагменти зшиваються ДНК.
Зшивка по однойменних"Липким" кінцям (рестріктазного лігазная метод)
Цей метод є самимпоширеним і популярним. Вперше цим способом гібридна ДНК булаотримана С. Коеном з співробітниками в 1973 році. Деякі рестріктази, наприкладPst I, вносячи в ланцюзі ДНК симетричні, розташовані навскіс один від одногорозриви на рівних відстанях від центру сайту впізнавання і утворюють"Сходинку" (рис. 36). Ці комплементарні один одному ділянки маютьтенденцію до асоціації за рахунок спаровування підстав, і тому їх називаютькомплементарними або липкими кінцями. Парування підстав відбувається тількиміж комплементарними послідовностями, тому ААТТ-кінці, утворені EcoRI, не будуть паруватися, наприклад, з АГЦТ-кінцями, утворюваними Hind III. Але будь-якідва фрагменти (незалежно від їх походження), що утворилися під дієюоднієї і тієї ж рестріктази, можуть злипатися за рахунок утворення водневихзв'язків між однониткових ділянками комплементарних нуклеотидів (рис. 39).
Однак після такогоспаровування повній цілісності подвійної спіралі не відновиться, оскількизалишиться два розриву в фосфодіефірнимі остові. Для його відновлення, тобтозшивання, або лігування ниток використовують фермент ДНК-лігази. Цей фермент вживій клітині виконує ту ж функцію - зшивання фрагментів ДНК, що синтезуютьсяпри реплікації.
Зшивка по"Тупим" кінцям (коннекторний метод)
Липкі кінці не абсолютнонеобхідні для зв'язування фрагментів ДНК. Тупі кінці також можуть бутиз'єднані за рахунок дії ДНК-лігази, якщо і лігаза, і тупі кінціприсутні в реакційній суміші у високих концентраціях. У цьому випадку реакціялігування має свої особливості і її ефективність нижча, ніж при зшиванню полипким кінців. Вперше такі експерименти були виконані в 1972 році Полем Бергомв Стенфордському університеті, США. Липкі кінці також можна ферментативним шляхомприєднати до молекул ДНК з тупими кінцями. Для цього використовують фермент -концевую трансферазу з тимуса теляти, яка приєднує нуклеотиди до 3-Кінців ланцюгів ДНК. Якщо до 3'-кінців одного з рекомбініруемих in vitroфрагментів ДНК за допомогою кінцевий дезоксинуклеотидилтрансферазы добудуватиодноцепочечниє оліго (dA)-сегменти певної довжини, а до кінців іншогофрагмента - оліго (dT)-сегменти приблизно такої ж довжини, то при змішанніотриманих таким чином фрагментів відбувається спарювання за рахунок освітиводневих зв'язків між оліго (dА) - і олігo (dT)-послідовностями (рис.40). Для ковалентного з'єднання двох фрагментів використовується ДНК-лігаза. Ці процедурискладають основу для другого загального методу отримання рекомбінантних молекулДНК.
Оскільки можнаформувати досить довгі взаімокомплементарние одноцепочечниє кінці,гібридні молекули утворюються з високою ефективністю. Зокрема, томупри клонуванні ДНК-копій матричних РНК, які доступні в обмеженихкількостях, звичайно іс В¬ товують коннекторний метод. При такому способіз'єднання між фрагментами вбудовуються ділянки АААА. Такі додатковіпослідовності ТТТТТ можуть впливати на функції з'єднуються молекул і томузавжди, коли тільки можливо, для отримання рекомбінантних молекул ДНКкористуються липкими кінцями, утвореними внаслідок дії рестриктаз.
Зшивка фрагментів зрізнойменними липкими кінцями
У ситуації, колинеобхідно зшити фрагменти, утворені різними ендонуклеазами рестрикції, імають різні, тобто некомплементарни один одному липкі кінці, застосовуютьтак звані Лінкер (або "перехідники"). Лінкер - це хімічноси...
