МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИРОСІЙСЬКОЇ ФЕДЕРАЦІЇ
Федеральне агентство з освіти
Сибірський федеральний університет
Інституту фундаментальних БІОЛОГІЇ ІБІОТЕХНОЛОГІЇ
Звіт
РОЗДІЛЕННЯ ПІГМЕНТІВ методом паперовоїХРОМАТОГРАФІЇ та кількісного визначення оптичних методів
студентка IV курсу
В.Н.Захарьіна
Науковий керівник:
Горбаньова Т.Б
Красноярськ 2008
1. Характеристикапігментів
ксантофилла (від грец. xanthГіs-жовтий іphГЅllon - лист), кисневмісні каротиноїди; головна складова частинажовтих пігментів у листках, квітках, плодах і нирках вищих рослин, а такожу багатьох водоростях і мікроорганізмах. У тваринному світі ксантофілл зустрічаютьсярідше (в курячому жовтку, печінці і жировій тканині ссавців). Містяться вхлоропластах зелених частин рослин, в хромопласти квіток і плодів, вліпофільних ділянках бактеріальних клітин. У поєднанні з флавоноїдами створюютьосіннє фарбування листя. Біологічне значення ксантофиллов пов'язано з їхздатністю поглинати енергію сонячного світла в короткохвильовій частинівидимого спектру (380-520 нм). Всі фотосинтезуючі органи в зелених рослинахі фотосинтезуючих мікроорганізмах містять ксантофілл У цих органахвідбувається перенесення поглиненої ксантофиллом світлової енергії на хлорофіл абоподібну йому систему. Т. о., Ксантофілл беруть участь у фотосинтезі в якостідодаткових пігментів. По-видимому, ксантофілл грають також рольсвітлофільтрів, що захищають чутливі до світла ферменти від руйнування.Відомо більше 50 різних ксантофиллов з різними функціональними групами(Спирти, кетони, альдегіди, окиси, прості і складні ефіри), що відносяться доациклічним, моноцікліческіх і біциклічною каротиноїдам, що містить 40атомів вуглецю. Типові представники ксантофілл - зеаксантин, C40H56O2, -жовті кристали (tпл 207-215 В° С) і ізомерний йому ксантофилл, або лутеін, -фіолетові кристали (tпл 190-193 В° С). Біосинтез ксантофілл з безбарвнихкаротиноїдних вуглеводнів проходить за участю кисню повітря на світлі [3].
Каротиноїди - пігменти, які містяться врослинах, стійких до знижених температур. Коли хлорофіл вичерпуєтьсяв холодну пору року, листи здобувають помітну жовту або помаранчеве забарвленняза рахунок пролонгованої дії пігменту каротиноида. Каратиноїди захищаютьрослини від згубної дії сонячного світла, приймаючи УФ - випромінювання сонцяна себе, трансформуючи в енергію і передаючи її хлорофілу. За допомогою такоїпередачі хлорофіл регулюють процеси фотосинтезу. На доказ того, щокаротиноїди присутні в листі постійно на рівні з хлорофілом, послужитьнаступний приклад: до спиртової витяжки хлорофілу прилить бензину 1:1, збовтатисуміш і дати відстоятися, суміш розшарується. Нижній шар зі спирту має жовтузабарвлення і містить жовтий пігмент ксантофілл. Верхній бензиновий шар зеленогоі містить хлорофіл і каротин. Оранжево-червоний колір рослинам дає пігменткаротин, жовту - ксантофилл. Ці пігменти мають білково-ліпоїдному основу. Ціпігменти виявлені в плодах помідорів, апельсинів, мандаринів, в кореніморкви. Основна роль цих пігментів - надати рослинам яскраву привабливузабарвлення, привертаючи птахів і тварин для рознесення насіння. Квіти зоранжево-жовтим забарвленням - жовтець, настурція [1].
Хлорофіл - зелений пігмент рослин, за допомогоюякого вони уловлюють енергію сонячного світла і здійснюють фотосинтез.Локалізована в особливих клітинних структурах - хлоропластах або хроматофорах іпов'язаний з білками і ліпідами мембран. Основу структури молекули Х, складаємагнієвий комплекс порфіринового циклу; до 4 піррольних кільці до залишкупропіонової кислоти приєднаний високомолекулярний спирт фитол, який надаєхлорофиллу здатність вбудовуватися в ліпідний шар мембран хлоропластів [2].
Вищі рослини і зеленіводорості містять хлорофіл а і в, бурі і діатомові водорості - а і з,червоні водорості - хлорофіл а і d. У фотосинтезуючих бактеріях присутні близькі аналоги хлорофіл а- Бактериохлорофилла. За своєю будовою хлорофіл близький до інших природнимкомплексам порфіринів (із залізом) - дихальним пігментам - цитохроми,барвника крові - гему, а також простетичної груп деякихферментів-пероксидази, каталази [3].
2. Хідроботи
Робота включає декількаетапів
Отримання витяжкипігментів - отцентріфугіровалі культуру водоростей, об'ємом 150 мл, при 5тис/об в хвилину, осад акуратно перенесли в ступку, додали трохи піску ірозчинника (суміш спирту і ацетону 3:1) і ретельно розтерли догомогенізованого стану. Екстракцію проводять наступним чином. У колбіБунзена на пробці зміцнили скляний фільтр № 4. На дно Кобля встановилипробірку, в яку опускається кінець скляного фільтра. Колбу з'єднали зповітряним насосом Камовского. Рідина з ступки зливається по склянійпаличці на фільтр, носик ступки попередньо змащується вазеліном зовні підуникнути розтікання розчину. У ступку приливає ще 4-5 мл розчинника івміст знову ретельно розтирається, потім рідина зливається в воронку іфільтрується в пробірку, вставлену в колбу Бунзена. Промивання проводитися дотих пір, поки витікаючий з воронки розчинник не стане безбарвним. Післяекстракції залишається сірувата маса без ознак наявності пігментів.Об'єднана порція екстракту доводитися розчинником до певного об'єму(10мл). Екстракт містить суму зелених і жовтих пігментів.
Спектрофотометрірованіе.
Визначення оптичноїщільності екстракту здійснюється на спектрофотометрі. Область оптичнихгустин в якій рекомендується працювати, лежить в межах 0,2-0,8. Якщооптична щільність екстракту вище, то його слід розбавити. Зразокрозбавили в три рази. Для кількісного визначення частину отриманогоекстракту наливають в кварцову кювету на 1 см. Друга кювета заповнюється чистимрозчинником (80% ацетоном). Кювети поміщають в кюветноє відділення і визначаютьпоглинання при довжинах хвиль, відповідних максимумів визначуваних пігментів.
Для обчислення зміступігментів отримані величини оптичної щільності підставляють у формули.
Удосконалення технікиспектрофотометричних вимірювань дозволило уточнити коефіцієнти отриманихраніше.
Удосконалення технікиспектрофотометричних вимірювань дозволило уточнити коефіцієнти отриманихраніше формул. А також зробило можливим визначення в сумарному субстратіпігментів не тільки хлорофілів а і в, але і каротиноїдів (мг/л) у 80% ацетоні.
З а = 12,21 * А 663 - 2,81 * А 646
С в = 20,13 * А 646 - 5,03 * А 663
Скар = (1000 * А 470 - 3,27 * Са -100 * Св)/229
Таблиця 1 Величиниоптичної щільності
варіант
О» = 470
О» = 646
О» = 663
Діна
1,5
0,45
1,062
Яна
0,38
0,7
0,225
Аня
0,65
0,1
0,44
Валя
0,28
0,375
0,16
Розрахували концентраціюпігментів, отримані дані занесли в таблицю 2.
Таблиця 2 Концентраціяпігментів у витяжці
З а (мкг)
С в (мкг)
З кар (мг/л)
Діна
35,1
10,8
14,1
|
