Зміст
Лекція 1. Устаткування біохімічній лабораторії. Загальніпринципи біохімічного дослідження
Лекція 2. Руйнування клітин і екстракція. Центрифугування
Лекція 3. Поділ білків шляхом осадження
Лекція 4. Буферні розчини та спеціальні добавки. Ультрафільтрація. Діаліз. Детергенти та їх застосування
Лекція 5. Загальні принципи хроматографії, класифікаціяхроматографічних методів
Лекція 6. Матеріали матриць сорбентів і обмінників. Технікаколонкової хроматографії
Лекція 7. Адсорбційна і розподільна хроматографії
Лекція 8. Тонкошарова хроматографія
Лекція 9. Іонообмінна хроматографія
Лекція 10. Іонообмінна ЖХВДбілків. Хроматофокусірованіе
Лекція 11. Аффинная хроматографія
Лекція 12. Гель-фільтрація
Лекція 13. Теоретичні та методичні засадиелектрофорезу
Лекція 14. Ізоелектричної фокусування та ізотахофорез
Лекція 15. Виявлення, кількісне визначення тахарактеристика макромолекул після електрофорезу
Лекція 16. Принцип імунного електрофорезу. Іммунофіксація
Лекція 17. Електросінерез. Електроіммуноаналіз
Лекція 18. Методи мічених атомів
Лекція 19. Спектрофотометричні методи аналізу
Лекція 20. Флюоріметріческіе методи аналізу
Лекція 21. Імуноферментний аналіз
Лекція 22. Радіометричнийаналіз. Мас-спектроскопія
Лекція 23. Блот-аналіз
Лекція 1. Устаткування біохімічній лабораторії. Загальніпринципи біохімічного дослідження
Джерела небезпеки та заходи безпеки в лабораторії припроведенні біохімічного аналізу. Особливості застосування загальних лабораторнихметодів в біохімічному експерименті. Мікро - і нанометоди.
Лабораторний посуд: матеріали для її виготовлення, вибіроптимального матеріалу залежно від поставленого завдання біохімічногоексперименту, види лабораторного посуду, біосумісні способи миття і сушкилабораторного посуду, особливі способи підготовки лабораторного посуду для біохімічногоаналізу.
Вихідні реактиви для біохімічної лабораторії. Відомості прореактивах: маркування реактивів, використання літературних і електроннихджерел довідкової інформації. Особливості зберігання реактивів длябіохімічного аналізу. Способи перевірки якості та чистоти реактивів, вибірспособу перевірки, адекватного поставленої аналітичної задачі. Методидодаткової підготовки та очищення реактивів для біохімічного аналізу. Перекристалізація.
Методи відбору реактивів в біохімічному аналізі. Зважування:види ваг для аналітичної біохімії, принципи і джерела похибокзважування. Дозування рідин, використання піпеточні дозаторів,можливі джерела похибок. Особливості приготування розчинів ваналітичної біохімії: принципи приготування, способи вираження,концентрацій, розчинності, розчинники для біохімічного аналізу, способипоступового додавання реактивів, розчинення погано розчинних речовин (суспендированием,емульгування, детергенти, використання яких допустимо в біохімічномуаналізі). Буферні розчини для використання в біохімічному аналізі.
Методи контролю температури в біохімічній лабораторнійпрактиці.
Необхідність проведення ряду біохімічних аналізів вспеціальних умовах. Техніка робіт з реагентами, чутливими до вологи,кисень повітря і світло. Проведення реакцій в апротонних розчинниках, вбезводних умовах і в інертній атмосфері. Техніка проведення фотохімічнихреакцій.
Лекція 2. Руйнування клітин і екстракція. Центрифугування
Принцип методу, основні визначення та формули. Центрифугуваннязастосовується для розділення неоднорідних рідких середовищ.
Центрифугування дозволяє розділити суміш, що складається здвох або більше компонентів з різною питомою щільністю, якщо принаймніодин з цих компонентів - рідина.
Поділ речовин за допомогою центрифугування засноване нарізному поведінці частинок у відцентровому полі. У відцентровому полі частинки,мають різну щільність, форму або розміри, осідають з різною швидкістю.
Швидкість осадження, або седиментації, залежить від відцентрового прискорення (G),прямо пропорційного кутової швидкості ротора (, в рад/с) і відстані міжчасткою і віссю обертання (г, в см): G = 2 • м. Оскільки один оборот ротораскладає 2л радіан, кутову швидкість ротора в оборотах на хвилину (об./хв) можназаписати так: v = 2p пЂЇ 60(Об./хв), а відцентрове прискорення тоді буде одно: G = 4p2 пЂЄ r/3600 (об./хв) 2.
Відцентрове прискорення зазвичай виражається в одиницях g{Гравітаційна постійна, рівна 980 см * с-1) і називається відноснимвідцентровим, прискоренням (ОЦУ), тобто ОЦУ = 4p2 пЂЄ r/3600 * 980(Об./хв) 2 або ОЦУ = 1,11 * 10-5 * r (об./хв) 2 (*)
На підставі рівняння (*) Доула і Котціас буласкладена номограма, яка виражає залежність ОЦУ від швидкості обертання ротора ірадіуса г - середнього радіусу обертання стовпчика рідини в центріфужной пробірці(Тобто відстані від осі обертання до середини стовпчика рідини).
Номограма для розрахунку відцентрового прискорення
Для визначення G з'єднують прямою лінією значення радіусу ішвидкості обертання ротора на крайніх шкалах; точка перетину цієї прямої зсередньої шкалою дає шукану величину відцентрового прискорення. Слід мати на увазі,що права колонка цифр шкали G відповідає правій колонці цифр шкалишвидкості обертання ротора; ліва - лівою.
Швидкість седиментації сферичних частинок залежить не тількивід відцентрового прискорення, але і від щільності і радіусу самих частинок і від в'язкостісередовища суспендування. Час осадження сферичної частинки в рідкому середовищі відменіска рідини до дна центріфужной пробірки обернено пропорційно швидкостіседиментації і визначається наступним рівнянням (закон Стокса, видозміненийСведбергом і Нікольс):
де t - час седиментації, с; h - в'язкість середовища, Паскаль • секунда; ГЧ - радіус частинки, см; рч- Щільність частинки (питома вага); p - щільність середовища (рідини) або питомавага; гм - відстань від осі обертання до меніска рідини, см; гд - відстаньвід осі обертання до дна пробірки, див
Як випливає з рівняння (**), при заданій швидкостіобертання ротора час, необхідний для осадження гомогенних сферичних частинок,обернено пропорційно квадрату їх радіусів і різниці щільності частинок ісередовища і прямо пропорційно в'язкості середовища. Тому суміш гетерогенних,приблизно сферичних частинок, що розрізняються по щільності і (або) розмірами,можна виділити або за рахунок різного часу осадження їх на дно пробірки приданому прискоренні, або за рахунок розподілу седіментірующіх частинок вздовжпробірки, що встановлюється через певний проміжок часу. Приподілі речовин необхідно враховувати і такі важливі фактори, як щільність ів'язкість середовища.
описані методи можна виділяти клітинні органели згомогенатов тканин. Основні компоненти клітини осідають в наступнійпослідовності: спочатку цілі клітини і їх фрагменти, потім ядра,хлоропласти, мітохондрії, лізосоми (або інші мікротільця), мікросоми (фрагментигладкою і шорсткою ендоплазматичної мережі) і, нарешті, рибосоми.
Осадження несферичних часток не підпорядковується рівнянню (**),тому частки однакової маси, але різної форми осаджуються при різнихшвидкостях. Ця особливість використовується при дослідженні конформаціїмакромолекул.
препаративне центрифугування полягає у виділеннібіологічного матеріалу для подальших біохімічних досліджень.
За допомогою препаративного центрифугування виділяють великукількість клітинних частинок для вивчення їх морфології, структури табіологічної активності. Метод застосовується для виділення таких біологічнихмакромолекул, як ДНК і білки, з попередньо очищених препаратів.
Аналітичне центрифугування застосовується головним чиномдля вивчення чистих і практично чистих препаратів макромолекул або частинок,наприклад, рибосом. У даному випадку використовується невелика кількість матеріалу,а се...
