ВСТУП
В даний час використовуютьсякілька підходів в одержанні трансгенних тварин. Найбільш широкопоширений метод мікроін'єкцій чужорідної ДНК (чДНК) в пронуклеус зигот.Оптимальні умови для проведення мікроін'єкцій в пронуклеус зигот мишейописані в роботі Брінстера і співавторів (1994).
Величина введеної ДНКможе досягати 30 Mb. Інтеграціядекількох копій (від 1 до декількох сотень) екзогенної ДНК в геном відбувається,як правило, в одному сайті в орієнтації "голова до хвоста" або"Голова до голови". При ін'єкції декількох рекомбінантнихконструкцій, їх вбудовування в геном, також відбувається в одному сайті.
Інший підхід в отриманнітрансгенних тварин полягає в інфікуванні ранніх ембріонів ссавціврекомбінант-ниміретровірусамі. Недоліком цього методу є отриманнятрансгенних тварин з мультісайтовой інтеграцією трансгена та його нестабільноїнаслідуваних в поколіннях.
Ще одним підходом уодержанні трансгенних тварин є використання трансформованихчужорідної ДНК, ембріональних стовбурових клітин, шляхом ін'єкції останніх впорожнину бластоцисти. Основною перевагою даного методу є можливістьпроводити спрямований мутагенез на рівні цілого організму, за допомогоюгомологічною рекомбінації чужорідної ДНК з геномної ДНК.
Для отримання трансгеннихтварин використовувалися й інші методи, до яких відносяться: застосуваннясперматозоїдів, оброблених екзогенної ДНК, для запліднення яйцеклітин вумовах in vitro; використання ліпосом в якості вектора чужорідноїДНК. Однак, ці методи мають значно менш широке поширення, уПорівняно з методом мікроін'єкції чужорідної ДНК в пронуклеус зиготи.
1. МЕТОДИТрансгенезу У ТВАРИННИЦТВІ
Трансгенні тварини -це індивідууми, в геном яких штучно введена додаткова генетичнаінформація (трансгени). Така інформація являє собою або окремийділянка ДНК з власними (гомологічними) регуляторними послідовностями(Еукаріотичних транскрипційних одиниця), або сконструйований з різнихмолекул ДНК гібридний (рекомбінантний) ген. Таким чином, трансгени - цештучно введений і інтегрувати в ДНК тварин чужорідний ген. Підтрансгенезу розуміють процес переносу та інтеграції чужорідної генетичноїінформації в геном тварин.
1.1 Методмікроін'єкції
Вперше про отриманнятрансгенних сільськогосподарських тварин повідомили дві лабораторії в США іНімеччині [Hammer et al, 1985; Brem et al., 1985]. В обох випадках для переносугенних конструкцій в ембріональні лінії був використаний метод мікроін'єкції.Цей метод і сьогодні залишається найбільш широко використовуваним для трансгенезу втваринництві.
Суть методу мікроін'єкціїполягає у введенні розчину генних конструкцій в чоловічій пронуклеус зигот.Зазвичай ін'еціруют 1-2 ПКЛ розчину ДНК у концентрації, відповідної 1000копіям в 1 ПКЛ мікроін'екціонного розчину. При цьому виходять з того, щокількість 1000 копій/ПКЛ приблизно відповідає концентрації X нг/мкл,де X - довжина генної конструкції в тисячах парах нуклеотидів (т.п.н). Наприклад,якщо довжина генної конструкції дорівнює 10 т.п.н., то кількість 1000 копій в 1 ПКЛбуде досягатися при концентрації дорівнює 10 нг/мкл.
Для більш точного розрахункуконцентрації генних конструкцій використовують наступну формулу:
Число копій (копій ПЛК) =6,023 * 10 23 * З * 10 -9 /Mr, де 6,023 * 10 23 - число копій в 1 М розчині;
С - концентрація ДНК[Мкг/мл];
Mr - молекулярна маса[Мг/моль].
Для розрахунку концентраціївимірюють оптичну щільність розчину генної конструкції на спектрофотометріпри довжині хвилі 260 нм. 1 OD відповідає концентрації двуточечной ДНК рівній50 мкг/мл. При розрахунку молекулярної маси виходять з того, що молекулярнамаса 1 п.н. дорівнює 6,6 * 108 мг/моль.
Про успішному виконанні мікроін'єкціїсудять по збільшенню об'єму пронуклеуса в 1,5-2 рази [Брем ​​и др., 1995]. Вембріонах мишей кроликів, овець і кіз пронуклеус досить добревізуалізуються під мікроскопом при збільшенні х400 без виконання будь-якихдодаткових маніпуляцій. Що стосується ембріонів свиней і великої рогатої худоби,то внаслідок наявності в цитоплазмі темних ліпідосодержащіх гранул визначеннямісцеположення пронуклеусов в них утруднено. Для зміщення цих гранул до краївембріона і полегшення тим самим локалізації пронуклеусов виконуютьцентрифугування ембріонів свиней і ВРХ при 15000 об/хв протягом 3 хв.[Wall et ai, 1985]. По завершенні мікроін'єкції ембріони культивують кількагодин до моменту їх пересадки в яйцепровід синхронізованих реципієнтів.Ембріони ВРХ культивують in vitro протягом 6-7 днів до досягнення ними стадійморули або бластоцисти і потім виконують пересадку в матку синхронізованихреципієнтів. Після народження від всіх тварин відбирають проби тканини для аналізу наінтеграцію трансгена. Ступінь інтеграції, тобто число трансгенних тварин відзагального числа народжених тварин, при використанні методу мікроін'єкції в залежностівід виду тварин коливається в незначних межах. Так, у мишей цей показникв середньому становить 15%, у свиней - 10-15%, у кроликів - 10%, у овець, кіз іВРХ -5-10% [Брем ​​и др., 1995]. Найбільш важливим, з точки зору витрат,потрібних для отримання одного трансгенної тварини, є показникзагальної ефективності трансгенезу, який розраховується як відношення числаотриманих трансгенних тварин до загального числа пересаджених ембріонів, вираженеу відсотках. Величина цього показника також щодо постійна істановить у мишей -2%, у кроликів 1%, у овець та кіз - 0,5 - 1%, у свиней і ВРХ- 0,5%. На частоту інтеграції впливає ступінь очищення ін'єкційногорозчину, форма і концентрація ДНК, склад буферного розчину, якістьембріонів, спосіб пересадки ембріонів реципієнтам (нехірургічний,хірургічний, лапароскопічний). При використанні розчину MSOF (синтетичнаСереда ембріонів) для мікроін'єкції зигот великої рогатої худоби (Hageman[1995]) було показано, що ін'єкція розчину MSOF не чинила впливу нажиттєздатність ембріонів великої рогатої худоби, отриманих in vitro. Так,частки ембріонів, які розвинулися до стадії бластоцисти, в групах MSOF і контрольноїстановили, відповідно, 27,6% і 27,5%. У групі ТІ до стадії бластоцистирозвинулися лише 13,9% ін'єктувати зигот. Зіставляючи результати двохнаведених вище досліджень, можна припустити, що буфер MSOF виявитьсябільш ефективним у порівнянні зі стандартним розчином ТІ для отриманнятрансгенного великої рогатої cкота та інших видів сільськогосподарськихтварин.
Не дивлячись на досягнутів області трансгенезу успіхи, ефективність одержання трансгеннихсільськогосподарських тварин залишається дуже низькою [Wall et al., 1992; Wall etal. 1997] що спонукає дослідників шукати нові підходи. Одним із шляхівпідвищення ефективності трансгенезу є розробка методів оцінки ембріонівна трансгенних перед іхпересадкой реципієнтам. До них відноситься використанняв конструкціях репортерний генів, таких як ОІ-галактозидаза, лужнафосфотаза та ін, а також визначення трансгенів в ембріонах методом ПЛР іфлюоресцентної гібридизації.
Не дивлячись навикористання великого числа маркерів, не було розроблено системи, що дозволяєпідвищити ефективність трансгенезу у сільськогосподарських тварин. Основніпідходи, ісполбзующіеся в даний час:
1.2 Використанняретровірусних векторів
Результативним способомпереносу ДНК у ембріональні лінії тварин є застосування ретровіруснихвекторів.
Ретровіруси - сімействоеукаріотичних вірусів, генетичний матеріал яких представленийодноланцюжкові РНК .
Віруси складаються покритихлипопротеидной оболчке вірусних частинок діаметром 70-120 нм і внутрішньоїкапсули ікосаедрічеськая форми, яка містить дві копії геномної РНК довжиною5-10 тисяч пар нуклеотидів у формі рібонуклеопротеідов. Зовнішня оболонка вірусує частиною цитоплазматичної мембрани клітини господаря і представленакороткими гліко...
