Зміст
Тези
Вступ
1. Метод генетичного нокауту
1.1 Особливостівекторних конструкцій
1.2 Внесення вектора в ембріональні стовбурові клітини
2. Роль метилювання ДНК в контролі генома
3. "Програмований нокаут генів"
4. Лінії нокаутних мишей
4.1 ФНП/ЛТ панель
4.2 BALB/cMBD2
4.3 B6SJL-Tg (SOD1-G93A) dl1Gur/J
4.4C57BL/MUC2
4.5 C57BL/6Kaiso
5. Приклади використання нокаутувавмишей для вивчення функцій генів і спадкових захворювань людини
Висновки
Список літератури
Тези
Нокаут гена (geneknockout) - це метод молекулярної генетики, при якому з організму видаляютьабо роблять непрацездатними задані гени. Таким чином отримують організм,нокаутний по непрацюючим генам. Нокаутние організми допомагають дізнатися функціїгенів, нуклеотидних послідовність яких відома. Відмінності міжнокаутним і нормальним організмом свідчать про функції виключеного гена.
Ця методика полягаєв цілеспрямованому внесення зміненого, мутованого гена в спадковуінформацію клітин. Новий ген вноситься в одержувані з ембріонів стволовіклітини, а результат оцінюється в дорослому тварині, тому поки не йдетьсяпро застосування даної технології у людей: багато роботи зі стовбуровими клітинамилюдини майже повсюдно заборонені, та й вирощування мутантних особин Homosapiens в експериментальних цілях представляється малореальним.
Стандартної біологічноїмоделлю, для якої розроблена методика, є лабораторні миші.
Лауреатами Нобелівськоїпремії 2007 року в галузі медицини і фізіології стали Маріо Капеккі, ОліверСмітіс і сер Мартін Еванс - розробники технології gene targeting - способузмінити окремі гени у ссавців. Мова йде про передній кордонісучасної науки про живе, справжньою генетичної інженерії, про яку мріявще Уеллс в "Острові доктора Моро".
Вступ
З перших дніввиникнення генетики як науки, вчені мріяли отримувати спрямовані мутації,зачіпають гени досліджуваних ними ознак. Першим кроком до здійснення цієїмрії було відкриття радіаційного та хімічного мутагенезу. Закінченнясеквенування геному людини в 2001 р. [28,12] вивело на новий рівеньдослідження по виявленню нових генів і функціонально значимихпослідовностей геному. В даний час біотехнологія та біоінформатика вкомбінації з класичною біохімією і генетикою є потужним інструментомдля аналізу вже наявної послідовності генома людини і модельнихорганізмів. Але справжній прорив в області спрямованих мутацій був здійсненийзавдяки використанню феномена гомологічною рекомбінації між порівняноневеликою ділянкою екзогенної та клітинної ДНК. Даний метод отримав назвуспрямованої інактивації гена або нокаут гена (від англ. knockout, синонім -gene targeting). Знаючи послідовність досліджуваного гена людини, сталоможливо за допомогою інактивації гомологічного гена у модельного організмувизначити біохімічну і фізіологічну роль його продукту. Оскількизначне число хвороб людини в своїй основі має спадковийкомпонент, моделі захворювань, створені з використанням цієї стратегії,дозволяють розширити наше розуміння біохімії і фізіології спадковихпатологій і призведуть до створення нових підходів до лікування.
Лауреатами Нобелівськоїпремії 2007 року в галузі медицини і фізіології стали Маріо Капеккі, ОліверСмітіс і сер Мартін Еванс - розробники технології gene targeting - способузмінити окремі гени у ссавців. Мова йде про передній кордонісучасної науки про живе, справжньою генетичної інженерії, про яку мріявще Уеллс в "Острові доктора Моро".
1. Метод генетичногонокауту
Нокаут гена -це молекулярно-генетичний метод, в ході якого задумані дослідникомзміни вносяться в нуклеотидну послідовність досліджуваного гена або йогорегуляторних елементів. Миша є найбільш адекватним модельною твариноюдля використання технології інактивації генів. Це обумовлено наступнимипричинами:
а) миша -добре вивчений і доступний об'єкт;
б) геном мишіі людини містить приблизно однакову кількість генів;
в) схожістьамінокислотних послідовностей всіх білків людини і миші становить близько90%.
Однакосновною причиною використання миші в якості моделі для інактивації генає можливість ізолювання ембріональних стовбурових клітин, в якихбудь-який ген може бути модифікований [29]. Клітинні лінії, що містять модифікованийген, можуть бути привнесені в розвивається зародок, що дозволяє отриматихимерне тварина, яка несе штучно створену мутацію (рис. 1).
Рис. 1. Стратегія отримання лінії нокаутував мишей [5].
Молекулярно-генетичниммеханізмом, що дозволяє здійснювати інактивацію гена, є гомологичнаярекомбінація між екзогенної ДНК, що несе задумані дослідником зміни,і геномної ДНК об'єкта.
Класичнасхема отримання нокаутував мишей включає кілька етапів: одержаннявекторної конструкції, з подальшим внесенням її в культуру ембріональних стовбуровихклітин (ЕСК) і відбір трансформантів. Трансформовані ЕСК вносять в зародок, іотриманих химерних тварин схрещують для отримання лінії мишей, гомозиготнихза отриманою мутації (див. рис. 1).
1.1 Особливості векторних конструкцій
В залежностівід поставленої задачі використовуються два типи векторів: заміщаючий і Інтернейрони.Перший тип векторів дозволяє замінити ділянку гена мішені, в той час якдругий інтегрує в досліджувану послідовність. Будова обох типіввекторів однаково, крім орієнтації фланкують послідовностей (рис. 2).Найбільш часто використовуються заміщають вектора.
Рис. 2. Два типи векторів - заміщаючий (А) і вставний (Б) - і їхмеханізми інтеграції в геном [5].
Вектор длятрансформації несе клоновану послідовність досліджуваного гена, звнесеними до неї необхідними змінами. Це може бути: внесеннястоп-кодону, що приводить до синтезу короткого неактивного пептиду; делеція одногоабо декількох екзонів; делеція промоторні області; вставка, яка призводить допорушення нормального функціонування гена і будь-які інші зміни, які призводятьдо відсутності функціонального продукту досліджуваного гена або значно знижуютьйого активність. Також в цю послідовність вноситься позитивнийселективний маркер (МПС), яким є ген neo. Продукт цього гена даєнесучим його клітинам стійкість до антибіотиків неоміцину та канаміцину.Модифікована послідовність повинна бути фланкировалісь незміненимиділянками, по яких буде проходити рекомбінація. Ефективність рекомбінаціїзалежить від довжини фланкують послідовностей [22], що в свою чергузалежить від можливостей вектора (мал. 3). При довжині гомологичного плеча біля 5тис. п.н. відсоток рекомбінації становить 0,001.
Рис. 3. Залежність частоти інтеграції вектора від довжини гомологічнихплечей [22].
В якостівектора можна використовувати бактеріальні штучні хромосоми (BAC), зівставками фрагментів геному миші. У цьому випадку розмір одного плеча можескладати до 150 тис. п.н., а розмір делеції до 25 тис. п.н. Найкращий відсотокрекомбінації (8,3%) отриманий авторами з використанням довжини плеча 110 тис. п.н.[26].
Існуєймовірність, що рекомбінація пройде не по досліджуваним нами ділянкам геному, ав будь-який інший подібною області. При цьому ген neo (МПС) збережеться, і ввідібраному пулі ЕСК будуть присутні рекомбінантні клітини, не несутьнеобхідних змін. Ця проблема вирішується внесенням у векторну конструкціюмаркера негативної селекції (МОС). Ним може служити ген тимідину-кіназипростого вірусу герпесу (HSV-tk) або ген дифтерійного токсину А (DT-A),продукти яких вбивають еукаріотичні клітини. Положення МОС з зовнішньоїбоку гомологичного плеча вектора дозволяє елімінувати його післяпроходження гомологічної рекомбінації (рис. 4). У разі ж негомологічноїрекомбінації, МОС виявляється інтегрованим в геном трансформовано...
