Зміст
1. Іммобілізованіферменти. Методи іммобілізації
2. Застосуванняіммобілізованих ферментів
Література
1. Іммобілізованіферменти. Методи іммобілізації
іммобілізованих ферментів (Від лат. Immobiiis - нерухомий), препарати ферментів, молекули яких брало пов'язаніз матрицею, або носієм (як правило, полімером), зберігаючи при цьому повністюабо частково свої каталітіч. св-ва. Іммобілізовані ферменти зазвичай не розчин.у воді; між двома фазами можливий обмін молекулами субстрату, продуктівкаталітіч. р-ції, інгібіторів та активаторів.
Комерційневикористання ферментів обмежене низкою факторів. Найважливіші з них -нестабільність ферментів та їх висока вартість. Вартість можна істотнознизити за рахунок іммобілізації ферменту. Це означає, що фермент закріплюють наповерхні або всередині твердої підкладки, яку легко видаляють з реакційноїсуміші після завершення ферментації. Фермент може бути використаний повторно,що істотно знижує вартість процесу.
Інша перевагаіммобілізації полягає в тому, що фермент стає більш стабільним,ймовірно, за рахунок обмеження його здатності денатурувати при змінах рН,температури і розчинників. Приміром, іммобілізована глюкозоізомеразастабільна при 65 В° С протягом року, тоді як в розчині вона денатурує при 45В° С за кілька годин.
іммобілізованихфермент можна використовувати для безперервного (відкритого) виробництва, пропускаючиреагенти через фермент і збираючи продукт на кінцевому етапі.
Методи іммобілізаціїферментів
Існують різніспособи іммобілізації ферментів. Вони включають або механічне включення(Захоплення) ферменту, або його приєднання до певної структури, абоматриці. Перевагою методу захоплення є те, що фермент зберігається вприродному стані. Однак крупним молекулам важко дістатися до ферменту.
Фізична іммобілізаціяферментів являє собою включення ферменту в таке середовище, в якій длянього доступною є лише обмежена частина загального обсягу. При фізичноїіммобілізації фермент не пов'язаний з носієм ковалентними зв'язками. Існуєчотири типи зв'язування ферментів:
- адсорбція нанерозчинних носіях;
- включення в поригелю;
- просторовевідділення ферменту від решти обсягу реакційної системи за допомогоюнапівпроникною перегородки (мембрани);
- включення вдвофазну середовище, де фермент розчинний і може знаходитися тільки в одній зфаз.
Для іммобілізаціїферментів в гелі існує два основних способи. При одному з них ферментпоміщають у водний розчин мономеру, а потім проводять полімеризацію, врезультаті чого утворюється полімерний гель з включеними в нього молекуламиферменту. У реакційну суміш часто додають також біфункціональних(Що містять в молекулі два подвійні зв'язки) зшиваючі агенти, які надаютьутворюються полімери структуру тривимірної сітки. В іншому випадку ферментвносять у розчин готового полімеру, який потім якимось чином переводятьв гелевидний стан. Спосіб іммобілізації ферментів шляхом включення вполімерний гель дозволяє створювати препарати будь-якої геометричноїконфігурації, забезпечуючи при цьому рівномірний розподіл біокаталізатора вобсязі носія. Метод універсальний, застосовний для іммобілізації практичнобудь-яких ферментів, Поліферментні систем, клітинних фрагментів і клітин. Фермент,включений в гель, стабільний, надійно захищений від інактивації внаслідокбактеріального зараження, так як великі клітини бактерій не можуть проникнути вдрібнопористу полімерну матрицю. У той же час, ця матриця може створюватизначні перешкоди для дифузії субстрату до ферменту, знижуючи каталітичнуефективність іммобілізованого препарату, тому для високомолекулярнихсубстратів даний метод іммобілізації не застосуємо взагалі.
Захоплення кулькамиальгінату легко продемонструвати на лабораторних заняттях; він єнайбільш поширеним промисловим методом. Розчин, що містить фермент іальгінат натрію, по краплях вносять в розчин хлористого кальцію. Як тількикрапельки вступають в контакт з хлористим натрієм, вони негайно починаютьперетворюватися в гель; при цьому утворюються ідеальні за формою кульки гелю,містять всередині захоплений фермент. Для тривалого використання гель можнастабілізувати поліакриламід або приготувати його у вигляді пластин, якщопомістити його на тканинну основу.
Головною відмітноюознакою хімічних методів іммобілізації є те, що шляхом хімічноговзаємодії на структуру ферменту в його молекулі створюються нові ковалентнізв'язку, зокрема між білком і носієм. Препарати іммобілізованихферментів, отримані із застосуванням хімічних методів, володіють по крайнейміру двома важливими достоїнствами. По-перше, ковалентний зв'язок ферменту зносієм забезпечує високу міцність утворюється кон'югату. При широкомуваріюванні таких умов, як рН і температура, фермент не десорбується зносія і не забруднює цільових продуктів катализируемой їм реакції. Цеособливо важливо при реалізації процесів медичного та харчового призначення, атакож для забезпечення стійких, відтворюваних результатів в аналітичнихсистемах. По-друге, хімічна модифікація ферментів здатна призводити досуттєвих змін їх властивостей, таких як субстратна специфічність,каталітична активність і стабільність.
2. Застосування іммобілізованих ферментів
Кращим прикладомпроцесу, в якому успішно використовуються іммобілізовані ферменти, євиробництво кукурудзяного сиропу з високим вмістом фруктози. Він широковикористовується в США і Японії в якості підсолоджувача, наприклад, у фруктовихнапоях, так як він значно дешевше сахарози. Сироп готують із відноснодешевого джерела вуглеводів - крохмалю, одержуваного з кочерижек кукурудзянихкачанів. Процес здійснюється за участю трьох ферментів. Спочатку одержуютькрохмальну масу шляхом перемелювання (розтирання) кукурудзи, потім дві амілазиперетворюють крохмаль у глкжозний сироп. Знебарвлені і сконцентрований сиропдодають в різні харчові продукти і напої. За допомогою ферментуглкжозоізомерази можна перетворити цей сироп у суміш, яка містить рівнікількості глюкози і фруктози. Для цього сироп пропускають через колонку, вякій міститься фермент, іммобілізований шляхом адсорбції на целлюлозноміонообмінник. Активність ферменту з часом поступово знижується, томузазвичай використовують кілька колонок, що працюють одночасно. Фруктоза солодшеглюкози, хоча обидві містять однакове число калорій на одиницю маси. Цеозначає, що, використовуючи кукурудзяний сироп з високим вмістом фруктози, можнаотримати такий же солодкий продукт як з глюкозою, але з меншою кількістюкалорій. Щорічно в США виробляється близько 4 млн. тонн сиропу.
Першим іммобілізованимферментом, застосованим в промисловому масштабі, була аміноацілаза. Вона булавикористана в Японії в 1969 р. для виробництва амінокислот, що додаються вкорм тварин. На світовому ринку ця продукція користується великим попитом.
Кожна молекулаамінокислоти може існувати в двох формах, одна з яких єдзеркальним відображенням іншої, як права і ліва рука. Ці дві форминазиваються оптичними ізомерами і є право-і левовращающімі формами,або D-і L-формами (по напрямку обертання ними площини поляризації світла).Всі існуючі в природі амінокислоти є L-амінокислотами. Набагатолегше отримати амінокислоти шляхом хімічного синтезу, ніж виділяти їх зклітин, однак синтезовані амінокислоти утворюються у вигляді суміші рівнихкількостей D-і L-ізомерів. Проблема отримання L-амінокислот вирішується за допомогоюферментів, специфічно каталізують перетворення тільки однією з форм.Основні стадії процесу представлені у вигляді діаграми на малюнку.
Фермент иммобилизуютшляхом іонного зв'язування на колонці з носієм. Після безперервноїавтоматизованої роботи протягом 30 днів при 50 В° С активність ферментузнижується до 40%; для відновлення активності додають свіжий фермент. ВВнаслідок завдяки іммобілізації економиться 40% ферменту.
Інший прикладвикористання іммобілізованих ферментів - виробництво напівсинтетичнихпеніцилінів з природних пеніцилінів. Іммобілізований фермент хімічномодифікує одну з бічних груп молекули пеніциліну, що призводить допідвищенню антибіотичної активності пеніцилінів.
Література
1. Іммобілізовані ферменти.Сучасний стан та перспективи, під ред. І.О. Березина, т. 1-2, М., 1976.
2. Козлов Л.В. "Біоорганічнахімія ", 1980, т. 6, № 8, с. 1243-54.
3. Введення в прикладну етимологію.Іммобілізовані ферменти, під ред. І.В. Березина, К. Мартінек, М., 1982.
4. Тривит М. Іммобілізовані ферменти.Вступний курс і застосування в біотехнології. - М., 1983.
