Іонообмінна хроматографія
Основи методу
У іонообмінної хроматографіїрозділення компонентів суміші досягається за рахунок оборотного взаємодіїіонізуючі речовини з іонними групами сорбенту. Збереженняелектронейтральності сорбенту забезпечується наявністю здатних до іонногообміну протиіонів, розташованих у безпосередній близькості до поверхні.Іон введеного зразка, взаємодіючи з фіксованим зарядом сорбенту,обмінюється з протиіонів. Речовини, що мають різний спорідненість до фіксованихзарядом, поділяються на аніоніти або на катіоніту. Аніоніти мають наповерхні позитивно заряджені групи і сорбують з рухомої фазианіони. Катіоніти відповідно містять групи з негативним зарядом,взаємодіючі з катіонами.
В якості рухомої фазивикористовують водні розчини солей кислот, основ і розчинники типу рідкогоаміаку, тобто системи розчинників, що мають високе значення діелектричноїпроникності і велику тенденцію іонізувати з'єднання. Зазвичай працюють збуферними розчинами, дозволялося регулювати значення рН.
При хроматографічномуподілі іони аналізованого речовини конкурують з іонами, що містяться велюент, прагнучи вступати у взаємодію з протилежно зарядженимигрупами сорбенту. Звідси випливає, що іонообмінну хроматографію можназастосовувати для розділення будь-яких сполук, які можуть бути будь-якимчином іонізовані. Можна провести аналіз навіть нейтральних молекул цукрів увигляді їх комплексів з борат-іоном.
Іонообмінна хроматографіянезамінна при поділі ви-сокополярних речовин, які без перекладу впохідні не можуть бути проаналізовані методом ГРХ. До таких сполуквідносяться амінокислоти, пептиди, цукру.
іонообмінної хроматографіїшироко застосовують у медицині, біології, біохімії, для контролю навколишнього середовища,при аналізі вмісту ліків і їх метаболітів у крові та сечі, отрутохімікатів вхарчовій сировині, а також для поділу неорганічних сполук, в тому числірадіоізотопів, лантаноїдів, актиноїдів та ін Аналіз біополімерів (білків,нуклеїнових кислот і ін), на який зазвичай витрачали години або дні, за допомогоюіонообмінної хроматографії проводять за 20-40 хв з кращим поділом.Застосування іонообмінної хроматографії в біології дозволило спостерігати зазразками безпосередньо в біосередовищах, зменшуючи можливість перегрупування абоізомеризації, що може призвести до неправильної інтерпретації кінцевогорезультату. Цікаво використання даного методу для контролю змін,відбуваються з біологічними рідинами. Застосування пористих слабких аніонообменіковна сілікагелевой основі дозволило розділити пептиди. Механізм іонного обмінуможна представити у вигляді наступних рівнянь: для аніонного обміну
X - + R + Y - ↔ Y - + R + X - для катіонного обміну
X + + R - Y + ↔ Y + + R - X +
У першому випадку іон зразкаX - конкурує з іоном рухомої фази Y - за іонні центри R + іонообмінника, а в другомув конкуренцію з іонами рухомої фази Y + за іонні центри R - вступають катіони зразка Х + .
Природно, що іонизразка, слабо взаємодіють з іонообмінник, при цій конкуренції будутьслабо утримуватися на колонці і першими вимиваються з неї і, навпаки, більшсильно утримувані іони будуть елюіровать з колонки останніми. Зазвичайвиникають вторинні взаємодії неіонні природи за рахунок адсорбції абоводневих зв'язків зразка з неіонні частиною матриці або за рахунок обмеженої розчинностізразка в рухомий фазі. Важко виділити В«класичнуВ» іонообміннухроматографію в В«чистомуВ» вигляді, і тому деякі хроматографісти виходять земпіричних, а не теоретичних закономірностей при іонообміннійхроматографії.
Поділ конкретнихречовин залежить в першу чергу від вибору найбільш підходящого сорбенту ірухомої фази. В якості нерухомих фаз в іонообмінної хроматографіїзастосовують іонообмінні смоли і силикагели з прищепленими йоногенних груп.
Полістирольні іонообміннісмоли для ВЕРХ зерненой 10 мкм і менше володіють селективністю істабільністю, але сітчаста структура їх, що характеризується відстанню міжвузлами сітки 1,5 нм, що значно менше розміру пір застосовуваного дляадсорбційної хроматографії силікагелю (10 нм), уповільнює масообмін і,отже, значно знижує ефективність. Застосовувані в ВЕРХіонообмінні смоли являють собою в основному сополімери стиролу ідивинилбензола. Звичайно додають 8-12% останнього. Чим більше змістді-вінілбензола, тим більше жорсткість і міцність полімеру, вище ємність і, якправило, селективність і тим менше набухаемость.
Катіоніти отримують сульфуваннямматриці. Протон, іонносвязанний з сульфо-групою, може переміщатися і навітьйти за межі смоли в розчин. При цьому щоб молекула була в ціломуелектронейтральної, місце протона займає позитивно заряджений іон, якийз розчину переходить в смолу. Наприклад, при дії Na + Cl - на катионо-обмінну смолу в Н + -формі відбуваєтьсяреакція обміну:
Смола - SO 4 - H + + Na - в†’Смола - SO 3 - Na + + H +
Якщо реакція протікає докінця, то смола знаходиться в натрієвої (іонної) формі.
аніонообмінних смолотримують хлоруванням матриці і подальшим алкілі-вання аліфатичнихаміном.
Найбільш поширеніаніоніти, що мають четвертинні амонійні групи, отримані при алкілуваннітріметіламін.
У цих смолах рухливий аніонхлору, який може заміщатися іншим аніоном, наприклад ОН - Катіонітизвичайно поставляються в Н + -формі або Nа + -формі, а аніоніти -в ОН - -формі або Сl - -формі. Таким чином вказуєтьсяпротиіонів іоно-обмінника. Отримані матеріали, що містять сульфатні аботріалкіламмонійние групи, є сильними катіоннообменнікамі і сильнимианионообменниками і називаються відповідно SCX і SAX. Слабкі катіонообменнікі іанионообменниками отримують на основі карбоксилату СOO - або аміну NH + 3 відповідно. Існуютьтакож рідкі органічні ионообменники - неомешівающіеся з водою рідини,фізично нанесення на пористі або поверхнево-пористі матеріали. Рідкіанионообменниками - високомолекулярні аміни або їх солі, а катіонообменнікі-ефірифосфорної або фосфінових кислот.
Для поліпшення умовподілу в іонообмінної хроматографії іноді отримують лігандних комплексиіонів, змінюючи при цьому їх полярність
Fe 3 + + 4Cl - ↔ FeCl 4 - і ділять на аніонообміннихносії аніони заліза. Так як селективність смоли залежить від характерупротивоиона, часто необхідно змінити форму смоли. Протівоіони пов'язанікулоновскими силами взаємного притягання з іонообмінними групами і екрануютьїх заряд. Це тяжіння залежить від фізичної природи противоиона, розмірів,форми, щільності електронних оболонок. Одні протівоіони при рівностіконцентрацій можуть витісняти інші із зв'язку з іонними групами іонообмінника.Нижче наведені ряди протиіонів в порядку убутної активності та зменшенняспорідненості до іонообмінній смолі.
Знати ці ряди корисно длявибору системи елюювання. Найбільш швидкий метод перетворення аніоніти вформу, яка в ряду селективності стоїть вище вихідної, полягає в промиванніїї чотирикратним об'ємом 1 М розчину відповідної солі. Якщо дляроботи необхідна форма слабкіше вихідної, то її спочатку переводять вгідроксильну форму, промиваючи 20-кратним кількостям 1 М розчину NaOH, а потім вже перетворюють напотрібну форму. Катіоніти переводять в необхідну форму промиванням 1 М розчиномнітрату відповідного металу.
При зміні іонної формисмоли або в присутності органічних розчинників, таких, як ацетонітрил,тетрагідрофуран, може змінюватися і обсяг смоли. Я...
