Міністерствосільського господарства
Російськоїфедерації
Федеральнедержавне освітня установа
Вищогопрофесійної освіти
В«АЛТАЙСЬКИЙДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ В»
Контрольнаробота
Студента
Заспеціальності
СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКАБІОТЕХНОЛОГІЯ
Виконав студент
Перевірив (а)
Барнаул2009
Питання № 1. Ферментигенетичної інженерії
Ферменти генетичноїінженерії - це ферменти, що дозволяють проводити різні маніпуляції змолекулами ДНК: розрізати в певних місцях, з'єднувати різні попоходженням фрагменти, синтезувати нові, не існуючі в природіпослідовності, і т.д. Розглянемо основні ферменти генетичної інженерії.
ДНК-полімерази. Одним з найбільш часто використовуванихв генетичній інженерії ферментів є ДНК-полімераза ДЄ, виділеназ E . coli або фага Т4. ДНК-полімераза ДЄволодіє здатністю подовжувати ланцюг ДНК в напрямку 5 в†’ 3шляхом приєднання комплементарного нуклеотиду. Ця властивість ДНК-полімеразвикористовується в генній інженерії для побудови другого комплементарної ланцюга: придодаванні ферменту до одноцепочной ДНК-матриці в присутності праймеравідбудеться її подвоєння. Ця властивість використовується, наприклад, при створенніКДНК-бібліотек. ДНК-полімераза застосовується також для заповнення В«проломиВ» в ланцюзіДНК, наприклад, при застраіваніі фрагментів з виступаючими 5 - кінцями.екзонуклеазная активність ДНК-полімераз використовується для введення радіоактивноїмітки у фрагмент ДНК.
Використанняспецифічних термостабільних ДНК-полімераз - Tth- і Taq - полимераз - виділених з бактерій, що живуть вгейзерах, дозволило проводити ампліфікації - множинну напрацюваннябудь-якого фрагмента ДНК методомполімеразной ланцюгової реакції (ПЛР). Метод ПЛР, воснову якого покладена Taq - полімераза,не тільки спростив деякі старі методики генної інженерії, але і дозволивпроводити молекулярне маркування як окремих генів, так і цілих геномів.
З деяких вірусів булавиділена специфічна ДНК-полімераза - РНК-залежна ДНК-полімераза, названаобратнгой транскриптазой, або ревертазой. ревертазой можуть синтезуватикомплементарну ланцюг ДНК на РНК-матриці. За допомогою ревертазой можна отримуватикДНК-ДНК-копії мРНК. кДНК дозволяють вивчати будову генів і ідентифікуватиповноцінні копії цих генів у геномі.
ДНК-лігаза здійснює одну функцію -з'єднання фрагментів ДНК шляхом відновлення фосфодіефірних зв'язків міжсполуками нуклеотидами. Цей процес називається лігування. Найбільш частодля лігування в генній інженерії використовують ДНК-лігази фага Т4. за допомогоюлігази Т4 з'єднують будь-які фрагменти ДНК з будь-якими кінцями: В«липкимиВ» абоВ«ТупимиВ». Це один з найбільш часто використовуються ферментів.
нуклеаз - це велика група ферментів,каталізують реакцію гідролізу молекул нуклеїнових кислот. В результатідії нуклеаз молекула ДНК або РНК розпадається на фрагменти чи окремінуклеотиди. Вихідна функція нуклеаз в клітці - деградація непотрібних в даний моментжиттєдіяльності молекул (наприклад, деградація мРНК після трансляції) і захиствід чужорідних молекул нуклеїнових кислот (розщеплення фагової ДНКбактеріальними нуклеазами при зараженні бактерії фагом).
нуклеаз за типом їхдії можна поділити на групи. Нуклеази можуть діяти тільки намолекули і ДНК, і РНК одночасно (Нуклеази золотистої квасолі). Нуклеазивибірково можуть діяти на одноцепочечную (Нуклеази S1), абодвуцепочечной (екзонуклеаза ДЄДЄДЄ) молекули ДНК, або нагібридну ДНК - РНК-молекулу (рибонуклеаза Н).
Крім того, Нуклеазиможна розділити на два типи: на екзонуклеази і ендонуклеази .Екзонуклеази зазвичай гідролізують молекули з 5 - або 3 - вільнихрешт, а ендонуклеази можуть розщеплювати всередині послідовності фрагмента абокільцевої молекули ДНК.
рестриктаз. Окрему групу, особливо зутилітарною точки зору її застосування в генній інжененріі, являютьспецифічні ендонуклеази - рестріктази.
В основі методу,дозволив безпосередньо приступити до маніпуляцій з генами, лежить відкриттяферментів, названих рестрикційних ендонуклеаз (рестріктазамі). Ще в1953р. було виявлено, що ДНК певного штаму E . Coli , введена в клітини іншого штаму (наприклад, ДНКштаму В в клітини штаму С), не проявляє, як правило, генетичноїактивності, так як швидко розщеплюється на фрагменти ДНК-специфічнимиферментами - рестріктазамі. До теперішнього часу з різних мікроорганізміввиділено більше тисячі різних рестриктаз. В генетичної інженерії найбільшшироко використовуються коло 200.
рестриктаз предщставляютсобою особливий клас ендонуклеаз, які гідролізують ДНК строго по певнихспецифічним послідовностям, називаються сайтами рестрикції. кожназ рестриктаз дізнається свій свій сайт рестрикції і розрізає ДНК або всерединіпослідовності сайту рестрикції, або в безпосередній близькості від нього.Таким чином, при дії конкретної рестріктази одна і та жпослідовність ДНК буде завжди утворювати однаковий набір фрагментів.Позначення рестриктаз складається з початкових літер латинської назви видубактерій, з якого був виділений фермент, і додаткового позначення, такяк з бактерій одного виду може бути виділено декілька різних рестриктаз: Eschrichia coli - EcoR I . EcoRV . Haemophilus influenzae - Hinf I.Streptomices albus - Sal I. Thermus aquaticus - Taq I.
рестриктаз діляться накілька типів за характером розщеплення нуклеотидної послідовності.Рестріктази ДЄ ТИПУ дізнатися сайтів рестрикції, але розщеплюєтьсяПОСЛІДОВНІСТЬ ДНК на довільній відстані (від нсколькіх десятків додекількох тисяч пар нуклеотидів) від сайту впізнавання. Такі рестріктазинеможливо використовувати для вирішення генно-інженерних задач. Рестріктази ДЄДЄДЄтипу схожі на рестріктази ДЄ типу, вони гідролізують ДНК на на рвсстояніі20 - 35 н.п. від сайтів впізнавання і також досить рідко використовуються впрактичних цілях.
Ферменти, що використовуютьсядля отримання рекомбінантних молекул, - рестріктази ДЄДЄ типу. Основнийхарактеристикою таких рестриктаз є те, що у них сайти впізнавання і місцярестрикції збігаються. Зазвичай рестріктаза ДЄДЄ типу дізнається певнупослідовність на ДНК і гідролізує її всередині послідовності сайтурестрикції. Сайти рестрикції рестриктаз ДЄДЄ типу представленісиметричними при поаороте на 180 градусів послідовностями - паліндромів:
5 GAATTC 3
3 CTTAAG 5 сайт рестрикції рестріктази EcoR ДЄ
5 TAGA 3
3 ATCT 5 сайт рестрикції рестріктази TaqДЄ
рестриктаз ДЄДЄтипу поділяються на кілька класів у залежності від раразмера сайту рестрикції ідовжини одержуваних фрагментів ДНК:
1)мелкощепящіе -сайт рестрикції яких представлений чотирма нуклеотидними парами;
2)среднещепящіе -сайт рестрикції - 6 - 8 н.п.;
3)крупнощепящіе -сайт рестрикції - 10 - 14 н.п.
рестриктаз ДЄДЄтипу можна віднести до двох груп по тому, як вони розщеплюютьпослідовність ДНК. Одні вносять розриви по осі симетрії впізнаваноюпослідовності, а інші - зі зрушенням, з утворенням В«сходинкиВ». У першомувипадку утворюються так звані В«тупіВ» кінці, а в другому - В«липкіВ», тобтофрагменти мають на своїх кінцях однонітевиє взаємно комплементарні ділянки.
Утворення прирозщепленні рестріктазамі фрагментів з В«липкимиВ» кінцями:
5 G ↓ AATTC5 Березня C ↓ CGG 3
EcoR Ī 3 CTTAA ↑ G 5 Hpa ĪĪ 3 GGC ↑ C 5
Утворення прирозщепленні рестріктазамі фрагментів з В«тупимиВ» кінцями:
TA ↓ GA 5 березня GTT ↓AAC 3
Taq ДЄ 3 AT ↑ CT 5 Hinc Д...
