Принципи імуноферментного аналізу, основні види ІФА, застосування в діагностиці
Реферат
Самойлик Павло Володимирович інтерн кафедри В«Клінічної лабораторної діагностикиВ»
Російський державний медичний університет
2009
Введення.
Методи імунного аналізу широко ввійшли в медичну практику. У всіх областях сучасної медицини використовується імунний аналіз, переважно, з діагностичною і аналітичної цілями. Особливо важливо, що вони дають можливість ідентифікувати біологічні компоненти (гормони, ферменти, нейропептиди, продукти імунної системи, антигени і т.д.) в низьких і дуже низьких концентраціях. Всі продукти, проти яких можливе отримання антитіл, виявляються цими методами.
Імунний аналіз грунтується на взаємодії антигену (АГ) та антитіла (АТ) з використанням різних варіантів мічення одного з компонентів (фермент, радіонуклід, флуоресцентний барвник та інші). Оцінка реакції проводиться автоматично на спеціальній апаратурі, що дозволяє стандартизувати ці методи.
Залежно від типу використовуваної мітки і умов постановки тесту імунний аналіз позначається як імуноферментний (ІФА), радіоімунний (РІА), імунофлуоресцентного та інші. При постановці реакцій в один або декілька етапів вони позначаються як прямі або непрямі. Має значення середу, в якій проводиться реакція. Якщо реакція проводиться з реагентами, фіксованими на поверхні, то тест позначається як твердофазних, наприклад ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).
У даній роботі буде розглянуто тільки імуноферментний аналіз - метод широко поширений в біології та медицині, як практичної, так і фундаментальної.
Імуноферментний аналіз.
ІФА з'явився в середині 60-х років і спочатку був розроблений як метод для ідентифікації антигена в гістологічному препараті, а також для візуалізації ліній преципітації в тесті імунодифузії і іммуноелектрофореза, а потім став використовуватися для кількісного визначення антигенів і антитіл в біологічних рідинах. В розробці методу брали участі Є. Енгвалл і Р. Пелман, а також незалежно від них В. Ван Вееман і Р. Шурс.
Малюнок 1. Основний прінцип ІФА.
1) Для виявлення антигенів. 2) Для виявлення антитіл.
Метод заснований на специфічному зв'язуванні антитіла з антигеном, при цьому один з компонентів кон'юговані з ферментом, в результатереакціі з відповідним хромогенним субстратом утворюється забарвлений продукт, кількість якого можна визначити спектрофотометрично (рис. 1).
Відкриття можливості іммобілізації антигену та антитіла на різних носіях із збереженням їх зв'язує активності дозволило розширити використання ІФА в різних областях біології і медицини.
Поява моноклональних антитіл послужило подальшому розвитку ІФА, що дозволило підвищити його чутливість, специфічність та відтворюваність результатів.
Теоретично ІФА грунтується на даних сучасної імунохімії та хімічної ензимології, знанні фізико-хімічних закономірностей реакції антиген-антитіло, а також на головних принципах аналітичної хімії. Чутливість ІФА і час його проведення визначається декількома основними чинниками: кінетичними, термодинамічними характеристиками реакції антиген-антитіло, співвідношенням реагентів, активністю ферменту і роздільною здатністю методів його детекції. У загальному вигляді реакція антиген-антитіло може бути описана простою схемою:
[AT] + [АГ] ↔ [Атаги]
Різноманітність об'єктів дослідження від низькомолекулярних сполук до вірусів і бактерій, а також надзвичайно широке коло завдань, пов'язаних з різноманіттям умов застосування ІФА, обумовлюють розробку надзвичайно великої кількість варіантів цього методу.
Будь-який варіант ІФА містить 3 обов'язкові стадії:
1. стадія впізнавання тестованого сполуки специфічним до нього антитілом, що веде до утворення імунного комплексу;
2. стадія формування зв'язку кон'югату з імунним комплексом або з вільними місцями зв'язування;
3. стадія перетворення ферментної мітки в реєстрований сигнал.
Класифікація ІФА.
В основу класифікації методів ІФА покладено кілька підходів:
1. За типом реагентів, присутніх на першій стадії ІФА, розрізняють конкурентний і неконкурентний методи.
А) У конкурентному ІФА на першій стадії в системі присутні одночасно аналізоване з'єднання і його аналог, мічений ферментному і конкуруючий за центри специфічного зв'язування з ним.
Б) Для неконкурентних методів характерна присутність в системі на першій стадії тільки аналізованого з'єднання і специфічних до нього центрів зв'язування.
2. Всі методи ІФА делют на гомогенні і гетерогенні.
Якщо всі три стадії ІФА проходять в розчині і між основними стадіями немає додаткових етапів поділу утворилися імунних комплексів від непрореагіровавшіх компонентів, метод відноситься до групи гомогенних.
В основі гомогенного ІФА, застосовуваного, як правило, для визначення низькомолекулярних субстанцій, лежить інгібування активності ферменту при його поєднанні з антигеном або антитілом. Активність ферменту відновлюється в результаті реакції антиген-антитіло.
При зв'язуванні антитіла з антигеном, що містить ферментну мітку, відбувається інгібування активності ферменту на 95% по відношенню до високомолекулярних субстратів, що обумовлено стеричним винятком субстрату з активного центру ферменту. У міру збільшення концентрації антигену зв'язується все більше антитіл і зберігається все більше вільних кон'югатів антиген-фермент, здатних гідролізувати високомолекулярний субстрат. Аналіз проводять дуже швидко, для одного визначення потрібно 1 хвилина. Чутливість методу досить висока. З його допомогою можна визначити речовину на рівні пікомоль.
Для гетерогенних методом характерне проведення аналізу в двофазної системі за участю твердої фази - носія, і обов'язкова стадія поділу імунних комплексів від непрореагіровавшіх компонентів (відмивання), які знаходяться в різних фазах (Утворилися імунні комплекси знаходяться на твердій фазі, а прореагували комплекси - в розчині). Гетерогенні методи, в яких формування імунних комплексів на першій стадії протікає на твердій фазі, називають твердофазного методами.
Методи відносяться до гомогенно-гетерогенним, якщо 1 стадія - утворення специфічних комплексів відбувається в розчині, а потім для розділення компонентів використовують тверду фазу з іммобілізованими реагентом.
3. За принципом визначення тестованого речовини:
А) Пряме визначення концентрації речовини (антигену або антитіла) по числу провзаімодействующіх з ним центрів зв'язування. У цьому випадку ферментна мітка буде знаходитися в утворився специфічному комплексі АГ-АТ. Концентрація визначуваної речовини буде прямо пропорційна регистрируемому сигналу.
Б) Визначення концентрації речовини по різниці загального числа місць зв'язування і залишилися вільними центрів зв'язування. Концентрація визначуваної речовини при цьому буде зростати, а реєстрований сигнал знижуватися, отже, в даному випадку простежується зворотна залежність від величини реєстрованого сигналу.
Характеристика компонентів, використовуваних в ІФА.
Ферменти.
Ферментні мітки володіють надзвичайно мощьний каталітичним дією, одна молекула ферменту може реагувати з великою кількістю молекул субстрату. Таким чином, фермент, присутній в незначних кількостях, можна виявити і кількісно визначити по утворенню продуктів, що каталізується їм реакції. Інша перевага застосування ферментів в якості міток обумовлено наявністю в молекулі численних функціональних груп (сульфгідрильних, карбоксильних, залишків Тирозин та ін), через які можна ковалентно приєднати молекули ліганду.
Ферментні маркери, які використовуються в ІФА, повинні мати наступні властивості:
- висока активність і стабільність фермен...
