Мембраннібілки: характеристика і структурні принципи
1.Структура мембранних білків
Основнароль ліпідів у складі мембран полягає в стабілізації біслойной структури,а білки є активними компонентами біомембран. Ми обговоримо деякіпринципи, що виявилися корисними для з'ясування структурних особливостеймембранних білків. Ми наведемо приклади, що ілюструють ці принципи.
Назорі розвитку мембранології вважали, що мембранні білки за своєю структуроюдосить гомогенні і укладені у вигляді 3-шарів по поверхні бішару. Заразскоріше схильні вважати, що принаймні у трансмембранних білків ті їхділянки, які занурені в мембрану, містять а-спіралі. Звичайно, дужехотілося б зробити якісь однозначні висновки з цього приводу, але вони повиннігрунтуватися на фактичних даних. Перед лицем величезної структурногорізноманітності розчинних білків приходиш до висновку, що інтегральнімембранні білки можуть виявитися набагато складніше, ніж ми зараз представляємо.Класифікація розчинних білків за типами структур була проведена тільки післятого, як встановили з високою роздільною здатністю структуру більш 100 різнихбілків. Що стосується трансмембранних білків, то це вдалося зробити тільки водному випадку - для білка фотосинтетичного реакційного центру бактерій.Разом з електронно-мікроскопічними даними низького дозволу про структурубактериородопсина це єдине джерело, на якому може грунтуватисяпобудова моделей для більшості інших трансмембранних білків.
Щеодин важливий момент - способи прикріплення білків до мембрани. Вони схематичнопредставлені на рис. 3.1.
1.Зв'язування з білками, зануреними вбішар. В якості прикладів можна навести Fi-частина Н + -АТРази,яка пов'язує ся з Fo-частиною,зануреної в мембрану; можна згадати також деякі білки цитоскелету.
2.Зв'язування з поверхнею бішару. Цевзаємодія має в першу чергу електростатичну природу абогідрофобну. На поверхні деяких мембранних білків є гідрофобнідомени, які утворюються завдяки особливостям вторинної чи третинної структури.Зазначені поверхневі взаємодії можуть використовуватися як доповнення доіншим взаємодіям, наприклад до трансмембранному заякоріванню.
3. Зв'язування з допомогою гідрофобного В«якоряВ»; ця структуразазвичай виявляється як послідовність неполярних амінокислотних залишків.Деякі мембранні білки використовують в якості якоря кова-лентно пов'язані зними жирні кислоти або фосфоліпіди.
4. Трансмембранні білки. Одні з нихперетинають мембрану тільки один раз, інші - кілька разів.
Відмінностямиміж зовнішніми і внутрішніми мембранними білками не задається однозначно спосібїх прикріплення до Біслі; ці відмінності визначають лише відносну силу їхзв'язування.
2.Очищення мембранних білків
Дляочищення інтегральних мембранних білків і отримання їх в біохімічно активнійформі необхідні детергенти, що дозволяють солюбілізіровать білки і зберегти їхв розчині. Відповідні вимоги до детергентів і правилам поводження зними створюють додаткові проблеми крім тих, з якими зазвичай стикаютьсяпри очищенні білків. Для виділення інтегральних мембранних білків розробленобагато спеціальних методів, однак більшість схем очищення засноване на тих жехроматографічних та гідродинамічних методики, які використовуються длярозчинних білків. Це хроматографія на ДЕАЕ-целюлозі, сефароза абогідроксилу-патіте, гель-фільтрація, центрифугування в градієнті щільностісахарози і т. д. Дуже важливий правильний вибір детергенту, оскільки самедетергент руйнує біомембранах, займаючи місце ліпідів, оточуючих той чи іншийбілок, і визначає стабільність білка в розчині. Механізми діїдетергентів розглянуті в огляді.
2.1. детергентів
ВПротягом останніх двох десятиліть з'явилося дуже багато детергентів, придатнихдля очищення інтегральних мембранних білків. В принципі потрібно намагатися знайтитакий детергент, який не порушував би вторинну і третинну структуримембранних білків, а лише заміщав б більшість або всі мембранні ліпіди,контактують з гідрофобними ділянками білкової молекули. Кінцевою метоюсолюбілізації є вбудовування білка в детергентів міцели; подальшастратегія очищення полягає в поділі таких білково-детергентних комплексів.
Першапроблема - це підбір оптимальних умов солюбілі-зації досліджуваного білка.Детергенти, денатурирующие білки, не підходять для вирішення такої делікатноїзавдання. З іншого боку, багато детергенти недостатньо ефективно руйнуютьмембрани і утворюють белоксодержащие змішані міцели. Такі детергенти можутьбути або занадто гідрофобними, або занадто гідрофільними для ефективногозмішування з мембранними ліпідами і - при досить високій їх концентрації -для перетворення бішару в глобулярні змішані міцели. Спочатку сподівалися, щовибір необхідного детергенту вдасться систематизувати за допомогою одногопараметра, званого гідро-фільно-ліпофільним балансом. Цей параметр,змінюється від 1 до 20, використовується при одержанні сурфактантів в якостізаходи відносної гідрофобності. Дійсно, отримані якісь кореляції, зяких випливає, що значення ГЛБ детергенту може використовуватися дляпередбачення його поведінки в біологічних системах. Взагалі кажучи, можнасказати, що детергенти зі значенням ГЛБ в діапазоні від 12,5 до 14,5 є найбільшефективними розчинниками інтегральних мембранних білків. Однак згодомз'ясувалося, що пошук оптимальних детергентів для певного мембранногобілка вимагає врахування багатьох факторів і завжди повинен супроводжуватися емпіричноїперевіркою. Необхідно враховувати наступне.
1.Максімальнаясолюбілізація досліджуваного білка. Критерієм є перехід білка всупернатант після центрифугування, при якому відбувається осадження мембрани.
2.Солюбілізаціябілка в потрібній формі. Звичайно мова йде про збереження йогоферментативної активності, але іноді використовуються певні спектральніхарактеристики або наявність конкретних білкових асоціатів. Крім того,необхідною умовою є стабільність білка після солюбілізації. Вдеяких випадках для підтримки біохімічної активності разом з детергентомдодають екзогенні фосфоліпіди. Як приклад можна привести отриманнялактозопермеази Е. coli і білка натрієвого каналу. Іноді длястабілізації білка після солюбілізації додають гліцерин або інший поліол.Має сенс використовувати також інгібітори протеаз і проводити солюбилизацию вумовах, що зводять до мінімуму ймовірність їх протеолітичної розщеплення.
3.Возможностьвикористання детергенту вданою методикою. Необхідноперш за все враховувати заряд детергенту, поведінка при даному значенні рН, ККМі розмір міцел детергенту. Останні властивості особливо важливі. Детергенти знизькою ККМ, створюючі крупні міцели, не видаляються при діалізі абоультрафільтрації через занадто низької концентрації мономерів детергенту. Зпрактичної точки зору це означає, що якщо концентрувати білок здопомогою ультрафільтрації, то буде зростати і концентрація детергенту знизькою ККМ, а це може призвести до денатурації білка. З цієї причини багато дослідниківволіють використовувати детергенти з високими ККМ, наприклад октілглюкозід,солі жовчних кислот або більш сучасні цвіттеріонние детергенти. Вельмицінними є полістіреновие смоли, такі, як біобідз SM-2. Вонивибірково зв'язуються з детергентами типу тритон Х-100, видаляють їх зрозчину і дозволяють обійтися взагалі без діалізу. Ще один фактор, якийнеобхідно враховувати, - це поглинання світла детергентом. Деякі детергенти,наприклад тритон Х-100, поглинають в ближній УФ-області, що робить неможливимвизначення концентрації білка по вимірюванню оптичної щільності при довжиніхвилі 280 нм.
Зурахуванням усіх цих факторів стає зрозуміло, чому у багатьох випадках привиділенні інтегральних мембранних білків доводиться використовувати різнідетергенти. Наприклад, для солюбілізації можна застосовувати тритон Х-100, аподіл за допомогою ДЕАЕ-целюлози краще проводити в присутностіоктілглюкозіда. Детергенти можна міняти на стадії хроматографії, пі...
