План
Вступ
Розділ I Мікроскопічні дослідження як метод пізнанняклітини
1.1 Світлова мікроскопія та її можливості
1.1.1 Звичайна оптична мікроскопія
1.1.2Флуоресцентная мікроскопія
1.1.3 Фазово-контрастна і інтерференційна мікроскопія
1.2 Електронна мікроскопія
1.3 Рентгеноскопія
Розділ II Методи вивчення хімічного середовища живих клітин
2.1 Використання ядерного магнітного резонансу (ЯМР) для визначенняхімічних умов в живих клітинах
2.2 Використання внутрішньоклітинних електродів
2.3 Використання світловипромінювальних індикаторів
Розділ III Методи культивування клітин і визначення їхскладу
3.1 Методи культивування клітин
3.2 Фракціонування клітинного вмісту
Розділ IV. Технологія рекомбінантних ДНК
4.1 Виділення та фракціонування ДНК
4.2 Розщеплення ДНК рестріцірующімі нуклеазами
4.3 Секвенування ДНК
Висновок
Список використаної літератури
Вступ
Клітки дуже малі врозміром і складно влаштовані: важко розглянути їх структуру, важко визначитимолекулярний склад і ще важче встановити, як функціонують їх окреміелементи. Для вивчення клітин розроблено безліч експериментальних методів,можливості яких визначають рівень наших знань у цій області. Успіхи ввивченні біології клітини, включаючи найбільш дивовижні досягнення останніхроків, як правило, пов'язані з застосуванням нових методичних підходів. Томудля розуміння клітинної біології необхідно мати деяке уявлення провідповідних експериментальних методах.
Метою нашої роботи ми поставиморозгляд сучасних методів, використовуваних для вивчення клітин. Мирозглянемо сучасні методи, використовувані для вивчення клітин. Ми почнемознайомитися з тими з них, які дозволяють вивчати клітину як єдине ціле, іпотім звернемося до аналізу складових клітку макромолекул. Відправною точкоюстане мікроскопія, оскільки клітинна біологія почалася зі світловоюмікроскопії, і цей метод досі залишається вельми ефективним інструментомдослідження, поряд з більш сучасними пристроями для отриманнязображення, заснованими на електронних пучках чи інших формах випромінювання. Відпасивного спостереження ми поступово перейдемо до методів, що припускають активневтручання: розглянемо, як клітини різних типів можуть бути відокремлені відтканини і при цьому зберігати здатність рости, дізнаємося, як клітини можназруйнувати, а клітинні органели і складові їх макромолекули виділити вчистому вигляді. І, нарешті, ми викладемо суть технології рекомбінантних ДНК,завдяки якій стало можливим виділяти, секвенувати і маніпулюватигенами і, отже, вивчати механізми їх дії в клітці. Також мисистематизуємо їх, виділимо основні віхи, які вдалося досягти завдякиїх застосуванню.
Розділ I . Мікроскопічні дослідження якметод пізнання клітини
Діаметр типовою клітинитварин становить 10-20 мкм, що в п'ять разів менше найдрібнішої видимоїчастинки. Тільки з появою досконалих світлових мікроскопів на початку XIX століттявдалося встановити той факт, що всі тканини тварин і рослин складаються зокремих клітин. Це відкриття, узагальнене в формі клітинної теорії Шлейденом іШванном в 1838 році, знаменує собою початок клітинної біології.
Будучи надзвичайно малимиза розмірами, тваринні клітини до того ж безбарвні і прозорі: отже,відкриття їх основних структур стало можливим завдяки розробці наборубарвників в кінці XIX століття. Саме барвники забезпечили достатнійконтраст для спостереження субклітинних структур. Схожа ситуація спостерігалася впочатку 40-х років нашого століття, коли винахід потужного електронногомікроскопа зажадало нових методів збереження і забарвлення клітин. І тількипісля того, як вони були розроблені, почала проявлятися вся складністьклітинної структури. В основі мікроскопії як методології досі лежатьспособи приготування зразка і можливості самого мікроскопа.
1.1 Світлова мікроскопіяі її можливості
1.1.1 Звичайнаоптична мікроскопія
У загальному випадку випромінювання даної довжинихвилі може бути використано для вивчення тільки таких структур, мінімальнірозміри яких ще можна порівняти з довжиною хвилі самого випромінювання. Цей принципобмежує можливості будь-якого мікроскопа. Межа дозволу світловогомікроскопа задається довжиною світлової хвилі, яка для видимого світла лежить в межахвід 0,4 мкм (фіолетовий) до 0,7 мкм (темно-червоний). З цього випливає, щосамими маленькими об'єктами, які ще можна спостерігати у світловий мікроскоп,є бактерії і мітохондрії (їх ширина ~ 0,5 мкм). Більш дрібні елементиклітини спотворюються ефектами, викликаними хвильовою природою світла.
Для приготуванняпостійного препарату, який можна забарвити і спостерігати в мікроскоп, клітиниобробляють фіксуючим агентом з тим, щоб иммобилизировать, вбити ізберегти їх. У сучасних методах, як правило, використовується обробкаальдегідами, наприклад, формальдегідом або глутаральдегідом, які формуютьковалентні зв'язки з вільними аміногрупами білків і, таким чином, зшивають сусіднімолекули.
Після фіксації тканинизазвичай ріжуть на дуже тонкі "скибочки" (зрізи) на мікротоми. Зрізитовщиною від 1 до 10 мкм поміщають на поверхню предметного скла. В якостіукладають середовищ використовують парафін або спеціальну смолу. У рідкому вигляді ці середовищапросочують і оточують фіксовану тканину: потім вони тверднуть приохолодженні або за рахунок полімеризації, утворюючи твердий блок, який зручнорізати на мікротоми.
Існує серйознанебезпека того, що процедури фіксації або укладення можуть пошкодити структуруклітин або клітинних макромолекул. Ось чому запропонований інший методприготування зрізів - швидке заморожування. Заморожену тканину ріжуть накриостате в спеціальному мікротоми, встановленому в холодній камері.
У вмісті більшостіклітин, що складаються, як правило, на 70% з води, практично відсутнікомпоненти, здатні перешкодити проходженню світлових променів. Тому вприродному стані більшість клітин навіть після фіксації і приготуваннязрізів практично невидимі у звичайному світловому мікроскопі. Одна з можливостейїх побачити полягає в забарвленні клітин барвниками.
1.1.2Флуоресцентнаямікроскопія
Оскільки більшістьмакромолекул представлені в клітинах відносно незначним числом копій,одна або дві молекули барвника, пов'язані з макромолекулою, можуть залишатисянепоміченими. Альтернативний підхід до проблеми чутливості полягає ввикористанні флуоресценції.
Флуоресціюючі барвникипоглинають світло однієї довжини хвилі і випромінюють світло іншої довжини хвилі, більшдовгою. Якщо таку речовину опромінити світлом, довжина хвилі якого збігається здовжиною хвилі світла, що поглинається барвником, і потім для аналізу використатифільтр, що пропускає світло з довжиною хвилі, відповідної світла, випромінюваногобарвником, флуоресціюють молекулу можна виявити за світінням на темному полі.Висока інтенсивність випромінюваного світла є характерною особливістю такихмолекул.
Застосуванняфлуоресціюючих барвників для фарбування клітин припускає використанняспеціального флуоресцентного мікроскопа. Такий мікроскоп схожий на звичайнийсвітловий мікроскоп, але тут світло від освітлювача, випромінюваний потужним джерелом,проходить через два набори фільтрів - один для затримання світла перед зразком іінший для фільтрації світла, отриманого від зразка.
Флуоресцентнамікроскопія часто використовується для виявлення специфічних білків або іншихмолекул, які стають флуоресціюючими після ковалентного зв'язування зфлуоресціюючими барвниками. Наприклад, флуоресціюючі барвники можуть бутипов'язані з молекулами антитіл, що відразу ж перетворює їх на високоспецифічніі зручні фарбувальні реагенти, селективно зв'язуються зі специфічнимимакромолекулами на пов...
