сом. При цьому З'-кінцевий фрагмент ДНК служить затравкою дляподовження цієї ДНК на РНК-матриці. На стадії елонгації виступаюча ланцюг ДНКподовжується до кінця матриці. Ця реакція здійснюється РНК-залежноїДНК-полімеразної активністю теломерази.
Після подовженнявиступаючої ланцюга ДНК до кінця матриці відбувається транслокація, тобто переміщенняматриці і білкових субодиниць ферменту на заново синтезований кінецьтеломеразной ДНК, і весь цикл повторюється знову. Після завершення подовженняодноцепочечной З'-кінцевій теломерной послідовності другий ланцюг ДНК(С-ланцюг) добудовується за допомогою звичайної ДНК-полімерази. Таким чиномвідбувається вирішення проблеми кінцевий реплікації ДНК у еукаріот.
Рис. 1. Реплікаціятеломерна ділянок еукаріотичних хромосом (Цитовано за [1]):
А - виникнення недорепліцірованія5'-кінця лінійної хромосоми і синтез на цьому кінцевій ділянці теломерна ДНК здопомогою теломерази;
Б - основні етапи синтезу теломернаповтору теломеразою
I.1.2 Механізм зворотної транскрипції
На зворотної транскрипціїзасноване розмноження ретровірусів (віруси, у яких геномом служить не ДНК, якзазвичай, а РНК) і ретротранспозонів (є транспозіціоннимі елементами,які не мають віріони частинок, і, отже, на відміну від ретровірусів,не можуть незалежно В«переносити себеВ» між клітинами), освіта такзваних ретропсевдогенов (або процессірованние псевдогени церетропоследовательності, які втратили свою функцію, вони несуть всі ознакифункціональних ретропоследовательностей, але мають молекулярні дефекти, якіне дають їм експресуватися) та добудовакінчиків хромосом (теломер), коротшають при кожному клітинному поділі. Якщо молекула ДНК пошкоджена - наприклад, піддалася розриву(Double-strand break, DSB) - для її лагодження необхідна матриця, в якійпослідовність нуклеотидів відповідає вихідному, В«правильномуВ» станомпошкодженої ділянки. Раніше вважалося, що в якості таких матриць завждивикористовуються інші молекули ДНК. Пізніше було встановлено, що іноді ціДНК-матриці синтезуються шляхом зворотної транскрипції на основі РНК за участюретротранспозонів.
При вивченніретровірусів, геном яких представлений молекулами одноланцюжкові РНК, буловиявлено, що в процесі внутрішньоклітинного розвитку ретровірус проходить стадіюінтеграції свого геному у вигляді дволанцюгової ДНК в хромосоми клітини-хазяїна.У 1964 р. Темін висунув гіпотезу про існування вірусспеціфічного ферменту,здатного синтезувати на РНК-матриці комплементарних ДНК. Зусилля,спрямовані на виділення такого ферменту, увінчалися успіхом, і в 1970 р.Темін з Мізутані, а також незалежно від них Балтімор відкрили шуканий фермент впрепараті позаклітинних віріонів вірусу саркоми Рауса. Дана РНК-залежнаДНК-полімераза отримала назву зворотній транскриптаза, або ревертаза.
Кожен віріон (повноцінна вірусна частка, що складається з нуклеїновоїкислоти та білкової оболонки) ретровірусів містить дві ідентичні ланцюга РНКрозміром від 8000 до 10 000 нуклеотидів. Області 5'-і 3'-кінців обох ланцюгівмодифіковані, як у всіх еукаріотичних мРНК (5'-кепи, З'-поліаденіловиехвости). Вірусні РНК мають 5 структурних елементів: 1) прямі повтори на 5'-іЗ'-кінцях РНК (R); 2)послідовність з 80 - 120 нуклеотидів, що знаходиться близько 5 кінцевогоповтору (U5); 3) послідовність з 170 -1200 нуклеотидів близько З'-кінцевого повтору (U3); 4) послідовність з 15 20 нуклеотидів (Р), вмежах якої клітинна тРНК комплементарно взаємодіє з ретровірусноїРНК, що створює праймер для синтезу перших ланцюга ДНК; 5) сегмент Pu, що знаходиться безпосередньо передповтором U3 і є сайтом дляпраймування другій ланцюга ДНК - такий сегмент однаковий у РНК всіх ретровірусівпевного типу.
Етапи зворотноготранскрипції:
1. НарощуваннятРНК-праймера на матрицях U5 і R в напрямку 3 'в†’ 5'. РольРНК-праймера виконує одна з клітинних тРНК (наприклад, триптофанового,проліновая і т.д.). На відстані приблизно 100 - 200 нуклеотидів від 5'-кінцяРНК (для кожного вірусу - це величина постійна) є ділянка,комплементарний З'-кінцевій послідовності молекули тРНК, якийвикористовується в якості затравки. Ця ділянка зазвичай позначають як pbs (від англ.primer binding site ділянку зв'язування затравки). Зворотній транскриптазасинтезує сегмент ДНК, комплементарний 5'-кінцевий послідовностівірусної РНК. Цей сегмент прийнято називати (-) В«strong-stopВ» ДНК,оскільки синтез ДНК після завершення копіювання 5'-кінця матриці тимчасовозупиняється. (-) В«Strong-stopВ» ДНК містить послідовності,комплементарні концевому району R ірайону U5. Таким чином, синтез ДНКпочинається недалеко від 5'-кінця матриці і утворюється короткий продукт. Але цейкороткий продукт (-) В«strong-stopВ» має послідовність,комплементарну також і З'-кінця вірусної РНК, а як відомо, для зняттяДНК-копії з З'-кінця матриці завжди потрібно праймер. У ретровірусівкомплемент З'-кінця матриці виробляється в В«зручномуВ» місці, а потім переноситьсяна В«своєВ» місце. Це відбувається наступним чином: 5'-кінець вірусної РНК,створюючий дуплекс з (-) В«strong-stopВ» ДНК, руйнується під впливомпритаманною зворотній транскриптазі активності РНКази Н.
2. РНКаза Н, специфічнадо РНК у складі гібридного РНК-ДНК дуплексу, розщеплює сегмент РНК цьогодуплексу. В результаті (-) В«strong-stopВ» (RU5) виявляється в однониткових формі і може взаємодіятиз З'-кінцем (з ділянкою R) тієїж самої або іншої молекули вірусної РНК, оскільки на З'-кінці РНК єповтор R..
3. Новосинтезованихкороткий ланцюг ДНК разом з праймером В«перестрибуєВ» на З'-кінець матриці івзаємодіє там з комплементарним їй ділянкою К.
4. Ланцюг ДНК подовжується, вяк матриці використовується інша частина вірусної РНК. На цій стадії вякості затравки виступає вже (-) В«strong-stopВ» ДНК; елонгація затравки призводить досинтезу (-) ланцюга ДНК, в якій відсутній комплемент району RU5, оскільки відповідна ділянка(+) Матриці був зруйнований РНКази Н.
5. До моменту завершеннясинтез перших ланцюга ДНК велика частина вірусної РНК руйнується РНКази Н.
6. Синтез З'-кінця другоїланцюга ДНК.
7. Видалення тРНК ізалишився ділянки вірусної (+) РНК РНКази Н.
8. Другий стрибок, врезультаті якого новосинтезованих другий ланцюг ДНК комплементарновзаємодіє з тРНК-зв'язує послідовність перших ланцюга.
9. Подовження З'-решткожній ланцюга, освіта дуплексу ДНК.
Вся послідовністьреакцій протікає без явного участі ферментів реплікації клітини-хазяїна(Топоізомерази, ХЕЛІКАЗИ, ПРАЙМАЗИ, ДНК-зв'язуючого білка, лігази і т.д.). Прицьому слід зазначити, що молекули вірусних ДНК довше молекул вірусних РНК,які послужили матрицею для зворотної транскрипції. Дійсно, до 5'-кінця(+) Ланцюга вірусної ДНК додалася послідовність U3, а до 3-кінця цього ланцюга - послідовність U5. В результаті на кінцях молекуливірус специфічної ДНК з'явився довгий (кілька сотень нуклеотидів) кінцевийповтор (ДКП або LTR.), що маєструктуру U3U5.
Рис.2. Схема зворотноготранскрипції ретровірусної РНК з утворенням двуцепочечной ДНК (Darnell J., et.al. Molecular Cell Biology. - NY: Scientific Amer. Books,1986. - P. 1052)
Синтез ДНК на РНК-матриціin vitro і ревертаза використовується в генетичній інженерії для синтезугенів і їх фрагментів, а також цілеспрямованого синтезу на матричних РНКкомплементарних молекул ДНК (кДНК) для розшифровки первинної структури РНК ібілків.
Рис. 3. Схема отриманнякДНК з використанням ревертази вірусу і трьох додаткових ферментів: полі(А)-полімерази, фрагмента Кленова ДНК-полімерази I і Нуклеази S1.(Цитовано за)
Реакцію зворотноїтранскрипції проводять в спеціально підібраних умовах з використаннямсильних інгібіторів РНКазной активності. При цьому вдається отримуватиповнорозмірні ДНК-копії цільових молекул РНК. В якості праймера при зворотномутранскрипції полі (А) - містять мРНК використовують олігo (dT)-праймер, а длямолекул РНК, які не мають З'-полі (А)-решт, - хімічно синтезованіолігонуклеотиди, комплементарні-кі...
