Мутації бактеріофагіввивчалися дуже інтенсивно не тільки з метою генетичного аналізу, але і дляодержання інформації про властивості самих фагів. Частота появи тих чи іншихмутантів в фагів потомстві варіює в досить широких межах: наприклад,деякі мутанти утворюються з частотою не вище 10, тоді як інші виникаютьз частотою 10 і вище. Несприятливий ефект високої частоти мутацій зазвичайкомпенсується дією відбору. Наприклад, мутант фага може бути витісненийдиким типом, який дає більший вихід фага.
Висока частотавспонтанного виникнення зазвичай характерна для таких мутацій, які можутьвідбуватися у багатьох сайтах одного локусу. У тих випадках, коли нормальнийознака відповідає функціональній формі гена, а мутантний з'являється врезультаті якогось зміни в будь-якій точці даного локусу, частота прямихмутацій буде вище, ніж частота зворотних, так як зворотні мутацій повинніприводити до відновлення нормального стану. Іноді ревертанти виявляютьсянасправді псевдоревертантамі: це відбувається або в результаті змін вякому іншому гені (супресорние мутації), або внаслідок змін у томуж гені, які обумовлюють іншу, але також активну форму продукту.
У зрілих фагових частокчастота вспонтанних мутацій дуже низька, але їх можна ідуціровать, впливаючиякими мутагенними факторами, наприклад рентгенівськими абоультрафіолетовими променями, азотистої кислотою, гідроксиламіном або алкилирующимиагентами. Азотиста кислота дезамінується підстави нуклеотидів, аетілметілсульфонат їх етілірует. Гідроксиламін перетворює щітозін в урацил. Призароженіі модифікованими фагами внаслідок помилок, що відбуваються приреплікації хімічно зміненою нуклеїнової кислоти, виникають мутації, іпотомство фага, що вивільняється з однієї бактерії, содеожіт як нормальні,так і мутантні частки. Однак, як і слід очікувати при обробці мутагеномфага, що містить одноланцюжкові ДНК, утворюється чистий клон мутанта.
Вивчення мутаційногопроцесу, що відбувається під час розмноження фага, має велике прямевідношення до аналізу розвитку фага. Спочатку розглянемо спонтанний мутаційнийпроцес. У бактеріальній клітині, в якій сталася мутащія фага, утворюєтьсяяк нормальний, так і мутантний фаг. Число мутантних фагових часток,містяться в популяції фага, що виходить з даної одиничної бактеріальноїклітини, очевидно, визначається характером репродукщіі фага, бо нові гениможуть утворитися лише шляхом реплікації предсуществовавшіх. Якщо ймовірністьданої мутації при кожній реплікації однакова, то число виниклих мутантівзалежить від механізму реплікації. Наприклад, якщо кожна нова копія генаутворюється незалежно від інших, то розподіл мутантних копій впотомстві фага з різних інфікованих бактерій буде випадковим. Якщо ж,навпаки, кожна з утворюються копій буде в свою чергу репродукуватися,то мутантні копії будуть зустрічатися групами, або клонами, що складаються змутантних В«сибсовВ».
Для перевірки цихпропозицій були проведені експерименти. Бактеріальні клітини заражали фагом Т2і підраховували бляшки, утворені мутантними частинками, - r-мутанти (викликають швидкий лізис).Потім знаходили розподіл за частотою клонів, що містять 1, 2, 3,. . .5, ...мутантів, і порівнювали знайдене розподіл з розрахованим, яке булозасноване на допущенні, що відтворення фагових генів - експонентнийпроцес, що складається з послідовних дуплікаций, а ймовірність мутірованіягена при кожній реплікації - величина постійна. Якщо ці припущеннясправедливі, то слід очікувати, що частота y, з якою утворюються клони, що містять
х (= 2) мутантів, буденаступною:
де m - ймовірність мутації, N - кінцеве число копій гена, а n - число генерацій фагових генів, отриманихв даному досвіді. Оскільки на практиці геноми фага реплікуються несинхронно,зручніше аналізувати розподіл мутантів, виходячи з частоти Yx освіти клонів, що містять x або більше мутантів:
Розподіл, отриманев експерименті дуже добре збігається з теоретичним, особливо якщо враховувативплив, який чинить на результати досвіду обмежена величина кожноговиходу фага - збірки зрілих фагових часток з фонду реплікується елементів. ЗОтримані дані свідчать, що реплікація генів фага - експонентнийпроцес, аналогічний розмноженню будь-якого організму, яке відбувається шляхомповторних поділів. Звичайно, ця аналогія носить чисто формальний характер іє просто наслідком підлозі консервативного механізму реплікації фаговоїДНК, тобто результатом освіти з кожної дволанцюжкові молекули ДНК двохнових дволанцюжкових молекул. [3]
Цікава ситуація булавиявлена ​​при аналізі розподілу мутантів, що утворилися в результатіобробки фага Т4 мутагеном етілметілсульфонатом. Виявилося, що клони з 1, 2,4, 8 мутантами зустрічалися приблизно з однаковою частотою. Відомо, щодія цього мутагену на фагової ДНК складається в етилування гуаніну. Томуотримані дані були інтерпретовані в тому сенсі, що для кожногоетілгуаніна, що входить до складу ДНК, існує деяка постійнаймовірність заміни на неправильне підставу. Отже, якась мутаціяможе виникнути з рівною ймовірністю в будь генерації фага і всі копії,утворюються після цієї події, будуть мутантами. Результати цього досвідупоказали, що ланцюга ДНК вихідних частинок фага Т4 неодноразово копіювалися всерединіоднієї зараженої бактеріальної клітини.
Модифікації,викликаються господарем
На додаток до мутаційбактеріофаги піддаються негенетичні змінам, в яких основна рольналежить клітини-господаря. Це явище отримало назву модифікацій,викликаються господарем (Luria,Human, 1952; Arber, 1965, 1974). Важливість цих модифікацій длямолекулярної біології полягає в тому, що вони продемонстрували здатністьвнутрішньоклітинного середовища викликати такі зміни в хімічному будовугенетичного матеріалу, за допомогою яких можна ідентифікувати клітиннілінії, які синтезують ДНК. Подібні явища були вперше відкриті на фагової ДНК,однак вони вірні і для будь ДНК бактеріальної клітини. Є також спостереження,згідно з якими цей феномен справедливий і для еукаріотичних клітин. В особливихвипадках можуть виникнути більш складні ситуації. Двостороннє обмеження фагадвома господарями іноді спостерігається, але воно не є обов'язковим.
Фаг, який відкидаєтьсяклітинами, здатний адсорбуватися на них і ін'єктувати свою ДНК. Однак частинаостанньої швидко руйнується і реплікації не відбувається. Деградація ДНКобумовлена ​​специфічними ендонуклеазами (рестріктази, або R-Нуклеази), які здатні впізнаватиособливі ділянки ДНК і розщеплювати їх, якщо вони не були модифіковані підвпливом М-ферментів. Після цього відбувається розщеплення ДНК екзонуклеазамі доокремих нуклеотидів. Бактеріальний штам може мати одну або декілька R-нуклеаз і одночасно М-ферменти,які оберігають власну ДНК клітини. Запропоновано зручна номенклатурацих ферментів. Згідно ряду даних, ділянки пізнавання R-нуклеаз не завжди збігаються зділянками розщеплення ДНК; можливо, фермент здатний мігрувати уздовж ланцюга,перш ніж він знайде ділянку, де ДНК піддасться розщепленню. Модифікаціїзазвичай полягають у метилюванні аденіну або цитозину в специфічнихділянках ДНК. Донором метильних груп при цьому служить S-аденозілметіонін. Ділянки, які здатні розпізнаватися R-і М-ферментами, часто єпаліндромів:
5 ... pGpTpPupPypApCp ... 3
3 ... pCpApPypPupTpGp ... 5
де Pu і Py позначають відповідно пуринів і піримідинів. Метилуваннянавіть одного ланцюга цілком достатньо для захисту послідовностей від діїрестріктази. М-і R-активностівходять до складу ферментного комплексу, побудованого з декількох субодиниць.Останні кодуються системою з трьох генів. Одна з субодиниць відповідальна зарозпізнавання нуклеотидної послідовності.
Функціональна рольмодифікацій, що викликаються господарем, неясна. Вони здатні захистити даний штамбактерій від масивного руйнування фагами, зростаючими на різних бактеріях. Вбільш загальному вигляді роль модифікацій можна визначити як захист від потрапляннянеприйнятною чужорідної ДНК в бактеріальну клітину і подальшого їїВ«ПриживленняВ». Бактерія А, яка від...
