стота їх спонтанноговиникнення дуже мала. Штучним шляхом з Використанням методів in vitro вдається отримати великікількості гаплоїдних рослин. Існує три способи отримання гаплоїдів звикористанням методу культури ізольованих тканин:
андрогенез - отримання гаплоїдних рослин на штучному живильному середовищіз ізольованих пиляків і мікроспор.
гіногенез - отримання гаплоїдних рослин на штучному живильному середовищіз ізольованих семяпочек;
партеногенез - отримання гаплоїдів з гібридного зародка, у якого черезнесумісності хромосом батьків втрачені батьківські хромосоми.
Утворилися в результаті елімінації хромосом батьківського геному гаплоїдніембріоїдів культивують на штучних поживних середовищах і отримуютьгаплоїдні рослини. Сорти ячменю Джерело та Одеська-15 були отримані комбінацієюпартеногенетичного методу з культурою ізольованих зародків за чотири рокизамість звичайних 10-12 років. Методом культури пиляків з сортів та гібридівм'якої і твердої пшениці в НВО В«Еліта ПоволжяВ» за чотири роки отримано більше2,5 тис. дігаплоідних ліній, які характеризуються гомогенністю істабільністю.
Триває розробка технології одержання гаплоїдів допомогоюкультури пиляків пшениці, ячменю, кукурудзи, озимого жита, картоплі. У культуріпиляків можливі два шляхи освіти гаплоїдний рослин. Перший - освітурослин шляхом ембріогенезу в пилкових зернах. При цьому усередині пиляків зокремих пилкових зерен виникають ембріоїдів. Вони проростають і дають гаплоїднірослини. Другий - утворення калюсу з клітин пильовика. Надалі вВнаслідок морфогенезу з калюсних клітин регенерують рослини. У цьому випадкуутворилися рослини не завжди бувають гаплоїдний і часто відрізняються поплоїдності. До кінця не з'ясовано, утворюються вони від поліплоідізірованнихгаплоїдний клітин або від злилися клітин.
гаплоїдії, отримані in vitro, можуть застосовуватися нетільки в практичній селекції, але і в роботах по генетичній інженерії, атакож з клітинної селекції. Пилкові зерна є в деяких випадках більшзручними, ніж протопласти, об'єктами для дослідів по генетичної трансформації.
кріозберігання рослин. кріозберігання соматичних клітин рослин врідкому азоті (температура - 196 В° С) - новий напрямок в біотехнології,що широко стало розвиватися з початку 70-х років XX сторіччя. Мета даноїтехнології полягає в збереженні в культурі in vitro генофонду, а також взабезпеченні селекціонерів в будь-який час генотипом, мають шукані ознаки:необхідна пилок для проведення гібридизації; унікальні і одиничні насіння,в тому числі не виносять зневоднення; трансформовані, мутантні,гібридні клітини різних видів рослин, здатних до морфогенезу in vitro; зіготіческіе ісоматичні зародки і т.д. В даний час розроблені умовикріозберігання для культивованих клітин більше 30 видів, калюсних культур(Близько 10 видів), ізольованих протопластів (8 видів), збереження меристем (25видів) і кінчиків стебла (13 видів). Пріоритет у цьому напрямі належитьІнституту фізіології рослин РАН і, зокрема, відділу культури тканин іморфогенезу, очолюваному проф. Р.Г. Бутенко.
При проведенні робіт по кріозберігання необхідно, перш за все,враховувати специфіку рослинних клітин: відбирати дрібні клітини, з маленькоювакуолью і зниженим вмістом води; розробляти в кожному окремому випадкупідходи заморожування і подальшого відтавання рослинних клітин. Прикріозберігання зустрічається ряд труднощів, одна з яких пов'язана із захистомзаморожуваних клітин і тканин від осмотичного стресу і механічного руйнуванняструктур у результаті утворення і росту кристалів льоду всередині клітини.Одночасно з цим необхідно правильно підбирати умови, що забезпечуютьвисоку виживаність клітин при відтаванні і рекультивації.
Незважаючи на різноманіття робіт у цьому напрямку, в них все жнамітилися загальні прийоми, що лежать в основі кріозберігання: обробка клітинперед заморожуванням, застосування кріопротекторів, дотримання певногорежиму заморожування в інтервалі від 0 до -40 В° С (в окремих випадках до -70 В° С), атакож спеціальні заходи при відтаванні об'єктів.
Процес кріоконсервації, як правило, починається з підготовкикультури клітин до заморожування. Це може бути досягнуто кількома способами,передбачають культивування клітин на поживних середовищах, що містятьрізні осмотично активні речовини: маніт або сорбіт в концентрації 2-6%,амінокислоти і серед них, в першу чергу, пролін, чиє значення для зв'язуванняводи в клітинах рослин широко відомо, а також у-аміномасляна кислота.
Підбір кріопротекторів, речовин, що зменшують пошкодження клітин відосмотичного та механічного стресу, проводять емпірично за принципомнайменшої токсичності та оптимального ефекту. Серед усіх відомихкріопротекторів виділяються такі легко проникають в клітини речовини, якдиметилсульфоксид (ДМСО, 5-10%), гліцерин (10-20%), а також непроникаючівисокомолекулярні-полівінілпіролідон (ПВП), декстран, поліетиленгліколь (ПЕГ)з молекулярною масою 6000.
Велике значення при кріозберігання має правильно підібранийрежим заморожування від 0 до -40 В° С. Як правило, для всіх об'єктіввстановлюється швидкість заморожування 0,5-1 В° С в хвилину і всю цю роботупроводять на спеціальному обладнанні, що забезпечує програмне заморожування.Такі прилади випускає спеціальне конструкторське технологічне бюро здослідним виробництвом при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини (м. Харків).
Таким чином, повільне заморожування і використаннякріопротекторів дозволяє звільнити клітку від вільної води, і при -40 В° Склітини стають повністю зневоднений, що дає можливість проводитиподальше заморожування, а саме занурювати ампули з рослинним матеріалом урідкий азот.
Зберігання матеріалу в рідкому азоті практично не лімітовано.Наприклад, в кріобанку Інституту фізіології рослин РАН зберігаються клітини моркви,які знаходяться в рідкому азоті близько 20 років, меристеми картоплі - більше 10років та ін
Відтавання і перевірка життєздатності клітин після зберігання врідкому азоті є останнім етапом технології кріозберігання. Якщозаморожування здійснюють повільно, поступово, то відтавання повинно бутипроведено якнайшвидше. Для цього ампули поміщають у водяну баню зтемпературою 40 В°, а іноді і 60 В° С і витримують до повного зникнення останньогокришталика льоду.
Для визначення життєздатності клітин після відтавання застосовуютьнайбільш простий, швидкий і цілком задовільний спосіб - забарвленнявітальним барвником (0,1%-ним феносафраніном або 0,25%-ним розчином синіЕванса), в результаті якої мертві клітини фарбуються, а живі немає. Остаточнимкритерієм, безумовно, служить чітке відновлення зростання і ділення клітин прирекультивації на штучних поживних середовищах після відтавання.
Експериментально було показано, що клітини після зберігання в рідкомуазоті не втрачають здатності до поділу, регенерації рослин, не зменшуєтьсяпродуктивність синтезу вторинних метаболітів (клітини продуценти) і т.д. Так,Інститутом фізіології рослин РАН спільно з НУО з картоплярстварозроблені методи кріозберігання меристем чотирьох сортів картоплі та показанаможливість з 20% зберігаються меристем регенерувати цілі рослини, якіпри висадці в полі не відрізнялися за всіма ознаками, включаючи темпи зростання іпродуктивність, від звичайних пробіркових рослин (С. Манжулін та ін, 1982).Більш докладно про техніку кріозберігання можна дізнатися з оглядових робіт О.С. Попова.
Таким чином, технологія, пов'язана з кріозберіганнярослинних об'єктів, розвивається і постійно удосконалюється. Безсумнівно,ця технологія має своє майбутнє, так як вже сьогодні кріобанк можутьзначно полегшити роботу селекціонерів, надавши їм можливість широковикористовувати пул генів сортів, в тому числі старої селекції і диких видів, атакож зникаючих видів рослин.
2. Клітинна селекція рослин
сомаклональної варіабельність . Метод культури ізольованих клітин,тканин і органів рослин in vitro, широко використовуваний для вир...
