використаний тільки для вивчення таких структур, мінімальні розміри якихспівставні з довжиною хвилі світлового випромінювання. Кращий світловий мікроскоп маєроздільну здатність близько 0.2 мкм (або 200 нм), тобто приблизно в 500 разів покращуєлюдське око. Теоретично побудувати світловий мікроскоп з великою роздільною здатністюнеможливо.
Багато компонентів клітини близькі по своїй оптичної щільностіі без спеціальної обробки практично не видно в звичайний світловий мікроскоп. Длятого, щоб зробити їх видимими, використовують різні барвники, що володіють певноювибірковістю.
На початку XIX в. Виникла потреба в кристалах для фарбуваннятекстильних тканин, що в свою чергу викликало прискорений розвиток органічноїхімії. Виявилося, що деякі з цих барвників фарбують і біологічні тканиниі, що було вже зовсім несподівано, часто переважно зв'язуються з певнимикомпонентами клітини. Використання таких виборчих барвників дає можливістьбільш тонко досліджувати внутрішню будову клітини. Наведемо лише кілька прикладів:
В·барвник гематоксилінзабарвлює деякі компоненти ядра в синій чи фіолетовий колір;
В·після обробки послідовнофлороглюцин і потім соляною кислотою одревесневшие оболонки клітин стаютьвишнево - червоними;
В·барвник судан IIIокращівает опробковевшей клітинні оболонки в рожевий колір;
В·слабкий розчин йодув йодистим калії забарвлює крохмальні зерна в синій колір.
Для проведення мікроскопічних досліджень більшу частину тканинперед фарбуванням фіксують. Після фіксації клітини стають проникними для барвників,а структура клітини стабілізується. Одним з найбільш поширених фіксаторівв ботаніці є етиловий спирт.
Фіксація і фарбування не єдині процедури, які використовуютьсядля приготування препаратів. Товщина більшості тканин занадто велика, щоб їхвідразу можна було спостерігати при високому дозволі. Тому виконують тонкі зрізина мікротоми. У цьому приладі використаний принцип хліборізки. Для рослинних тканинвиготовляють трохи більше товсті зрізи, ніж для тварин, оскільки клітини рослинзвичайно крупніше. Товщина зрізів рослинних тканин для світлової мікроскопії близько10 мкм - 20 мкм. Деякі тканини дуже м'які, щоб з них відразу ж можна булоотримати зрізи. Тому після фіксації їх заливають в розплавлений парафін або спеціальнусмолу, що насичують усю тканину. Після охолодження утворюється твердий блок,який потім ріжеться на мікротоми. Правда, для рослинних тканин заливка застосовуєтьсязначно рідше, ніж для тварин. Це пояснюється тим, що рослинні клітинимають міцні клітинні стінки, складові каркас тканини. Особливо міцні одревесневшиеоболонки.
Однак заливка може порушити структуру клітини, тому застосовуютьще й інший метод, де ця небезпека зменшена? швидке заморожування. Тут можнаобійтися без фіксації і заливки. Заморожену тканину ріжуть на спеціальному мікротоми(Кріотоме).
Заморожені зрізи, приготовані таким способом, мають явнуперевагу, оскільки в них краще зберігаються особливості природної структури.Однак їх важче готувати, а присутність кристалів льоду все ж порушує деякідеталі.
мікроськопістов завжди непокоїла можливість втрати та спотвореннядеяких компонентів клітини в процесі фіксації і забарвлення. Тому отримані результатиперевіряють іншими методами.
Вельми привабливою представлялася можливість досліджувати під мікроскопомживі клітини, але так, щоб більш чітко проявилися деталі їх будови. Такуможливість дають особливі оптичні системи: фазово-контрастний і інтерференційниймікроскопи. Добре відомо, що світлові хвилі, подібно хвилям води, можуть інтерферуватиодин з одним, збільшуючи або зменшуючи амплітуду результуючих хвиль. У звичайномумікроскопі, проходячи через окремі компоненти клітини, світлові хвилі змінюють своюфазу, хоча людське око цих відмінностей не вловлює. Але за рахунок інтерференціїможна перетворити хвилі, і тоді різні компоненти клітини можна відрізнити одинвід одного під мікроскопом, не вдаючись до фарбування. У цих мікроскопах використовують2 пучка світлових хвиль, що взаємодіють (накладаються) один на одного, підсилюючиабо зменшуючи амплітуду хвиль, що надходять в око від різних компонентів клітини.
Електронна мікроскопія
Можливості світлового мікроскопа, як уже було сказано, обмежуютьсядовжиною хвилі видимого світла. Його максимальна роздільна здатність становитьприблизно 0.2 мкм.
Великий крок вперед був зроблений в мікроскопії в 20-х роках нашогостоліття, коли було виявлено, що відповідним чином підібрані електромагнітніполя можна використовувати подібно лінзам для фокусування пучків електронів.
Довжина хвилі електрона значно менше, чет довжина хвилі видимогосвітла, і якщо замість світла використовувати електрони, то межа дозволу мікроскопаможе бути помітно знижений.
На основі всього цього був створений мікроскоп, в якому замість світлавикористовується пучок електронів. Перший електронний мікроскоп сконструювали в 1931м. Кнолл і Руска в Німеччині. Минуло, однак, багато років, перш ніж з'явилася можливістьвивчати за допомогою цього мікроскопа зрізи тканин. Лише в 50-і роки були розробленіметоди виготовлення зрізів, що володіють необхідними якостями. З цього часупочалася нова ера мікроскопії, і в науку буквально ринув потік інформації про тонкомубудову клітин (ультраструктури клітин).
Складнощі електронної мікроскопії полягають у тому, що для дослідженнябіологічних зразків необхідна спеціальна обробка препаратів.
Перша трудність полягає в тому, що електрони володіють дужеобмеженою проникаючою здатністю, тому слід виготовляти ультратонкізрізи, товщиною 50 - 100 нм. Для того, щоб отримати настільки тонкі зрізи, тканиниспершу просочують смолою: смола полімеризується і формує твердий пластмасовийблок. Потім за допомогою гострого скляного або алмазного ножа зрізи нарізають на спеціальномумікротоми.
Є ще одна складність: при проходженні через біологічну тканинуелектронів не виходить контрастного зображення. Для того, щоб отримати контраст,тонкі зрізи біологічних зразків просочують солями важких металів.
Існує два основних типи електронних мікроскопів. У трансмісивному(Просвечивающем) мікроскопі пучок електронів, проходячи крізь спеціально підготовленийзразок, залишає його зображення на екрані. Роздільна здатність сучасноготрансмісійного електронного мікроскопа майже в 400 разів більше світлового. Ці мікроскопимають роздільну здатність близько 0,5 нм (для порівняння: діаметр атома воднюблизько 0,1 нм).
Незважаючи на настільки високий дозвіл, що просвічують електроннімікроскопи мають великі недоліки:
В·доводиться працюватиз фіксованими матеріалами;
В·зображення на екранівиходить двовимірним (плоским);
В·при обробці важкимиметалами руйнуються і видозмінюються деякі клітинні структури.
Тривимірне (об'ємне) зображення отримують за допомогою скануючогоелектронного мікроскопа (ЕМ). Тут промінь не проходить через зразок, а відбиваєтьсявід його поверхні.
Досліджуваний зразок фіксують і висушують, після чого покриваютьтонким шаром металу? операція називається відтінення (зразок відтіняють).
У скануючому ЕМ сфокусований електронний пучок прямуєна зразок (зразок сканують). В результаті металева поверхня зразка випускаєвторинні електрони слабкою енергії. Вони реєструються і перетворюються у зображенняна телевізійному екрані. Максимальна роздільна здатність скануючого мікроскопа невелика,близько 10 нм, але зате зображення виходить об'ємним.
Метод заморожування-сколювання
Принципово нові можливості електронної мікроскопії відкрилисяпорівняно недавно, після розробки методу В«заморожування - сколюванняВ». За допомогоюцього методу досліджуються найтонші деталі будови клітини, при цьому виходить об'ємнезображення в трансмісивному електронному мікроскопі.
При звичайному заморожуванні в клітинах утворюються кристали льоду,які помітно с...
