ерхні живий або всередині фіксованої клітини. Для цієїмети зазвичай використовують два барвника - флуоресцеїну, який даєінтенсивну жовто-зелену флуоресценцію після порушення світло-блакитнимсвітлом, і родамін, обумовлює темно-червону флуоресценцію після порушенняжовто-зеленим світлом.
1.1.3Фазово-контрастна і інтерференційна мікроскопія
Можливість втрати абопорушення зразків в процесі їх приготування завжди турбуваламікроськопістов. Єдиний спосіб вирішити цю проблему полягає у вивченніживих клітин без фіксації або заморожування. Для цієї мети дуже кориснімікроскопи зі спеціальними оптичними системами.
При проходженні світлачерез живу клітину фаза світлової хвилі міняється згідно з коефіцієнтом рефракціїклітини: світло, що проходить через відносно тонкі або відносно товстіділянки клітини, такі, як ядро, затримується, і його фаза відповіднозсувається по відношенню до фази світла, що проходить через відносно тонкі ділянкицитоплазми. Як у фазово-контрастному, так і в інтерференційної мікроскопії використовуютьсяефекти інтерференції, що виникають при рекомбінації двох наборів хвиль, якіі створюють зображення клітинних структур. Обидва типи світлової мікроскопії широковикористовуються для спостереження живих клітин.
Найпростіший спосіброзгледіти деталі клітинної структури - спостерігати світло, розсіюютьсярізними компонентами клітини. У темнопольному мікроскопі промені відосвітлювача направляються збоку і при цьому в лінзи мікроскопа попадають тількирозсіяні промені. Відповідно клітка виглядає як освітлений об'єкт на темномуполе. Однією з основних переваг фазово-контрастної, інтерференційної ітемнопольній мікроскопії є можливість спостерігати рух клітин упроцесі мітозу і міграції
Відеокамери та відповіднітехнології обробки зображення значно збільшили можливості світловиймікроскопії. Це дозволило спостерігати клітини протягом тривалого часу принизької освітленості, виключаючи тривалий вплив яскравого світла (або тепла).Оскільки зображення створюється відеокамерою у формі електронних сигналів, йогоможна відповідним чином перетворити в числові сигнали, направити вкомп'ютер і потім піддати додатковій обробці для вилучення прихованоїінформації. Ці та подібні методи обробки зображення дозволяютькомпенсувати оптичні недоліки мікроскопів і практично досягти межідозволу.
Високий контраст,досяжний за допомогою комп'ютерної інтерференційної мікроскопії, дозволяє спостерігати навіть дуже дрібні об'єкти, як, наприклад, окремі мікротрубочки діаметряких менше однієї десятої довжини хвилі світла (0,025 мкм). Окремімікротрубочки можна побачити і за допомогою флуоресцентної мікроскопії. Однак вобох випадках неминучі ефекти дифракції, сильно змінюють зображення.Діаметр мікротрубочок при цьому завищується (0,2 мкм), що не дозволяє відрізнятиокремі мікротрубочки від пучка з декількох мікротрубочок.
1.2 Електроннамікроскопія
Взаємозв'язок довжини хвилісвітла і межі дозволу зберігається для будь-якої форми випромінювання, як длясвітлових променів, так і для електронів. Однак в останньому випадку межадозволу істотно нижче. Довжина хвилі електрона зменшується зі збільшеннямйого швидкості. В електронному мікроскопі з напругою 100000 В довжина хвиліелектрона дорівнює 0.004 нм, а згідно теорії, дозвіл такого мікроскопастановить 0,002 нм.
Загальна схемапросвітчастого електронного мікроскопа (ПЕМ) нагадує схему світлового, хочаелектронний мікроскоп значно більше і як би перевернуть. Джереловипромінювання - нитка катода, що випускає електрони з вершини циліндричної колонивисотою близько двох метрів. Оскільки при зіткненні з молекулами повітряелектрони розсіюються, у колоні повинен бути створений вакуум. Електрони,випромінювані катодного ниткою, прискорюються найближчим анодом і проникають черезкрихітний отвір, формуючи електронний промінь, що проходить у нижню частину колони.Уздовж колони на деякій відстані розташовані кільцеві магніти,фокусують електронний промінь, подібно скляним лінзам, фокусирующим промінь світлав світловому мікроскопі. Зразок через повітряний шлюз поміщають у вакуум колони,на шляху електронного пучка. Частина електронів у момент проходження через зразокрозсіюється згідно щільності речовини в даній ділянці, залишок електронівфокусується й утворить зображення на фотопластинці або на фосфоресціюючіекрані.
В електронному мікроскопіне можна спостерігати живі об'єкти. Тому тканини фіксують, зшиваючи клітини іклітинні структури глутаральдегідом, а потім обробляють осмієва кислота.Зразки зневоднюють, фіксують смолами і нарізають тонким скляним абоалмазним ножем.
Тонкі зрізи практичноє двовимірними зрізами тканини і не дозволяють судити про тривимірну структуруклітинних компонентів. Тривимірне зображення можна отримати післяреконструкції сотень серійних зрізів. В даний час розроблені більш пряміметоди отримання тривимірного зображення. Один з них полягає у вивченнізразка під скануючим електронним мікроскопом. Для отримання зображення впросвечивающем електронному мікроскопі використовують електрони, що проходять череззразок, а в скануючому електронному мікроскопі використовуються електрони,розсіюється або випромінювані поверхнею зразка. У даному випадку зразокповинен бути зафіксований, висушений і покритий тонкою плівкою важкого металу.Потім зразок сканується дуже вузьким пучком електронів. Таким чиномвідбувається формування єдиного, цілісного і значно збільшеногозображення.
Метод скануючоїелектронної мікроскопії забезпечує значну глибину фокусування; більштого, оскільки масштаби розсіювання електронів визначаються кутом поверхніпо відношенню до променя, на зображенні виникають чергуються світлі й темніділянки, що створюють враження тривимірності. Але цей метод застосуємо тільки длявивчення поверхні і його дозвіл порівняно невелика (близько 10 нм зефективним збільшенням приблизно 20 тис. раз). Даний метод практичнонепридатний для вивчення субклітинних органел і використовується виключно длявивчення цілих кліток і тканин.
Просвічуючийелектронний мікроскоп можна використовувати для вивчення поверхні зразка здуже великим збільшенням, спостерігаючи окремі макромолекули. Як і прискануючої електронної мікроскопії, на висушений зразок напилюється тонкаплівка важкого металу. Метал напилюється під певним кутом, так щовідкладення напилення плівки в деяких місцях товстіше, ніж у інших. Цейпроцес відомий як відтінення - тут виникає ефект тіні, що створюєвраження тривимірності зображення.
Приготовлені такимчином зразки можуть бути досить малі і тонкі, щоб електронний проміньпроникав крізь них; наприклад, таким способом можна аналізуватиіндивідуальні молекули, віруси і стінки кліток. Що ж стосується більш товстихзразків, то тут після відтінення необхідно видалити органічний матеріалклітини, при цьому на поверхні зразка залишиться тільки тонкий металевий відбитокабо репліка поверхні. Ця репліка потім підсилюється вуглецевою плівкою,після чого її можна помістити на сітку і вивчати в звичайному електронномумікроскопі.
У клітинної біології особливо успішновикористовуються два методи, засновані на отриманні механічних реплік. Один зних - метод електронної мікроскопії В«заморожування-сколювання" - даєможливість вивчати внутрішню будову клітинних мембран. Клітини заморожуютьпри температурі рідкого азоту (-196'С). Заморожений блок потім розколюють лезомножа. Скол часто проходить через гідрофобну середину подвійного шару ліпідів,оголюючи внутрішню поверхню клітинних мембран. Утвориться поверхнювідколу відтіняють платиною, органічний матеріал видаляють і вивчають отриманірепліки в електронному мікроскопі.
Метод "заморожування- Травлення " використовується для вивчення зовнішньої поверхні кліток імембран. В даному випадку клітини заморожують при дуже низькій температурі ізаморожений блок розколюють лезом ножа. Зміст льоду нав...
