коло кліток (і вменшою мірою всередині клітин) знижують сублімацією води у вакуумі при підвищеннітемператури (процес називають вакуумної сушкою) . Ділянки клітини,піддані такому травленню, потім відтіняють для готування платиновоїрепліки.
Для того щоб домогтисявисокої якості зображення, перешкоджають утворенню великих кристалівльоду. Це можливо при прискореному заморожуванні зразка. Один з методівтакого швидкого заморожування полягає в охолодженні до - 269 В° С рідким гелієм.Особливо вражаючі результати отримують після глибокого травлення швидкозаморожених клітин. Цей метод дозволяє виявляти структури внутрішньоговмісту клітин, демонструючи їх тривимірну організацію з винятковоючіткістю.
Оскільки в цьому випадку вмікроскопі під вакуумом спостерігають не зразки, а репліки, отримані післявідтінення металом, методи заморожування-сколювання і заморожування-травленняможна використовувати для вивчення заморожених нефіксованих клітин і виключитиризик прояву артефактів, викликаних фіксацією.
Використовуючи дляконтрастування відтінення солями важких металів, можна спостерігати велектронний мікроскоп ізольовані макромолекули, наприклад, ДНК або великівіруси.
На відміну відОднаккартина.З іншого боку,об'єкта.КористуючисьЦе робитьЗа
РозшифровкаВ даний часСаме
життєдіяльності.
Причастотах.Для вивченняСигнали,фосфат. значення.
Один зВони можутьплазматичної мембрани.часу. єсьмефективний і досить широко використовуваний метод, однак важливо пам'ятати, що вданому випадку процедурі мікроін'єкції піддається кожна клітина окремо,тому кількість клітин обмежена. Для підвищення проникності клітиннихмембран використовують потужний електричний розряд або хімічний вплив,наприклад, розчином детергенту низької концентрації. Електричний розрядстворює в плазматичній мембрані великі пори без пошкодження внутрішньоклітиннихмембран. Ці пори залишаються відкритими протягом декількох хвилин і навіть годин вЗалежно від типу клітин та інтенсивності електричного впливу. Черезці пори макромолекули можуть швидко входити в цитозоль чи залишати його. Приобмеженому впливі мембрана багатьох клітин відновлюється і клітинивиживають. Третій метод введення в клітини великих молекул полягає у злиттічасток, оточених мембраною і містять необхідні молекули, зплазматичною мембраною клітини.
Розділ III Методикультивування клітин і визначення їх складу
Структуру органел івеликі молекули можна вивчати під мікроскопом; для локалізації специфічнихмолекул в клітці розроблені ефективні методи фарбування. Однак щоброзібратися в молекулярних основах клітинної організації, необхідний детальнийбіохімічний аналіз. На жаль, біохімічні методи передбачаютьвикористання значної кількості клітин і в процесі дослідження клітинируйнуються. Якщо в якості зразка для біохімічного аналізу використовуватишматочок тканини, то після руйнування буде отримана суміш фрагментів різнихклітин. І якщо тканина утворена клітинами різного типу, що скоріше єправилом, ніж винятком, то розібратися в цій суміші буде просто неможливо.Для того, щоб витягти максимум інформації про всіх клітинах, складових тканини,розроблені методи розділення тканин на клітини і методи виділення окремихтипів клітин. Отриману щодо гомогенну популяцію клітин можнапіддавати аналізу безпосередньо, або попередньо розмноживши їх шляхомкультивування.
3.1 Методикультивування клітин
Більшість видів клітинрослин і тварин в сприятливих умовах здатні вижити, розмножитися інавіть диференціюватися. Використовуючи методи культури тканини, можна вивчати клітинипід мікроскопом або аналізувати їх біохімічно. Крім того, додаючи вкультуральний посудину і видаляючи з нього специфічні молекули, такі, як гормониабо фактори росту, ми можемо судити про їх вплив на клітини. Застосуваннязмішаних культур дозволяє вивчати взаємодію між різними типамиклітин.
У наш час культуризазвичай готують з клітинної суспензії, отриманої шляхом дисоціації тканини.Більшість клітин, що утворюють тканини багатоклітинних організмів, на відміну відбактеріальних клітин не здатні рости в суспензії. Для росту і поділу їмнеобхідна тверда поверхня. Спочатку, коли метод культивування тількиз'явився, в якості механічної опори використовували згусток плазми, але вНині його зазвичай заміняють поверхнею пластикової культуральноїчашки. Клітини дуже розрізняються по своїх потребах; деякі з нихздатні рости або диференціюватися тільки в тому випадку, якщо культуральначашка покрита компонентами позаклітинного матриксу, наприклад колагеном.
Розроблено спеціальнісередовища певного хімічного складу, що використовуються для культивуванняклітин різних типів. Поряд з низькомолекулярними речовинами вони містятьодин або декілька різних білкових факторів росту, необхідних клітинам длявиживання і проліферація в культурі: наприклад, деяким нервовим клітинам, як вкультурі, так і в організмі тварини необхідні слідові кількості фактора,стимулюючого зростання нервів. Були відкриті і інші фактори подібного типу,мають життєво важливе значення для розвитку клітин певних типів іпідтримання їх нормального існування.
Більшість клітинссавців у культурі гине після певного числа поділів; клітинишкіри людини, наприклад, перш ніж загинути, діляться 50-100 разів. Існуєприпущення, що обмежений термін життя клітин в культурі відображаєобмежений термін життя організму, з якого були отримані ці клітини. Інодів культурі з'являються мутантні клітини, які практично безсмертні. Вониможуть розмножуватися нескінченно і утворюють клітинну лінію. Ці клітини кращеростуть на твердій поверхні, і після утворення безперервного шару їхзростання, як правило, припиняється.
Зазвичай мутантні клітини,здатні до безперервного поділу, все ж відрізняються від ракових клітин,здатних до безперервного поділу. На відміну від інших клітинних ліній раковіклітини можуть рости, не прикріплюючись до якої твердої поверхні, іутворюють в культуральних чашках популяцію більш щільну, ніж популяції звичайнихклітин. Аналогічне властивість можна викликати експериментально і у нормальнихклітин шляхом трансформації їх опухолеродного вірусу чи якимосьз'єднанням. Отримані таким чином неопластичних трансформовані клітиннілінії здатні викликати утворення пухлин після введення в організм тварин.І трансформовані, і нетрансформованих клітинні лінії служать джереломвеликої кількості клітин одного типу і тому представляють велику цінністьдля дослідника. Такі клітинні лінії мають ще ту перевагу, що при -70 В° С їх можна зберігати невизначено довго і при цьому вони зберігають здатністьвиробляти життєздатні клітини після розморожування.
Генетичну однорідністьклітинних ліній можна посилити ще більше шляхом клонування, т. тобтовиділивши окрему клітку і дозволивши їй проліферіровать до утворення великоїколонії. Клон - це популяція клітин, що походять з однієїклітини-попередника. Клонування клітин використовується в основному для отриманняклітинних ліній, у яких мутація торкнулася певні гени. Дослідженнятаких мутантних клітин, дефектних по специфічному білку, дозволяє дізнатисябагато нового про функції білка в нормальних клітинах.
Дві клітини, зливаючись,утворюють гетерокаріони - одну комбіновану клітку з двома ядрами.Зазвичай, щоб здійснити злиття клітин, клітинну суспензію обробляютьінактивованими вірусами, або поліетиленгліколем. Обидва цих агента пошкоджуютьплазматичну мембрану клітини, що і приводить до злиття клітин. Освітагетерокаріонов дає можливість змішувати компоненти двох окремих клітин зметою вивчення їх взаємодії. Саме в дослідах по гібридизації клітин миші іклітин людини вперше були отримані дані, що свідчать про те, щобілки поверхні клітин людини і миші, що перебували спочатку на своїхполовинках гетерокаріони, швидко дифундують і перемішуються по всій йогоповерхні.
Після закінченняпевного часу гетерокаріони діл...
