спектру водорозчинних коштів виявилося неможливим, оскільки метод активної завантаження, застосовуваний при їх виробництві, придатний лише для обмеженого числа ліків, які мають природу слабких амфіфільних кислот або підстав (наприклад, антибіотики антрациклінового ряду типу доксорубіцину). Альтернативний лабораторний спосіб - формування ліпосом у водно-сольовому розчині ліки з наступним відділенням від невключівшегося агента - нетехнологічен.
Ми пропонуємо включати ліки в ліпідний бішар ліпосом у вигляді ліпідних похідних - ліпофільних проліків, які розщеплюються внутрішньоклітинними ферментами з вивільненням вихідного препарату. Такий підхід спрощує технологію отримання лікарських ліпосом і робить її універсальною. Більш того, в порівнянні з инкапсулирование у водний об'єм ліпосом, включення в бішар дозволяє поліпшити фармакологічні властивості системи доставки в цілому, завдяки зменшенню втрат ліки як в кровотоці, так і при взаємодії ліпосоми з клітиною. Очевидно також, що ліпідні похідні здатні до прямого трансмембранному переносу, що кардинально змінює механізм ендоцитозу і внутрішньоклітинного трафіку препарату і полегшує розвантаження ліпосом. Для порівняння, щоб забезпечити вихід ліки з водного об'єму Stealth-ліпосом після їх попадання в ендосоми клітини-мішені, пропонується використовувати рН-чутливі молекулярні тригери, в тому числі пептидні, фосфоліпідні та ін Низька ефективність внутрішньоклітинної розвантаження, обумовлена ​​жорсткістю ліпідного бішару (температура його фазового переходу перевищує 60 В° С) і утрудненим злиттям з клітинними мембранами - один з істотних недоліків Stealth-ліпосом.
Нами розроблені синтези ліпідних похідних широко застосовуються в клініці хіміотерапевтичних засобів: мелфалану (і його рацемату сарколизина) і метотрексату [4, 5]. Цітотоксіков мелфалан - алкілуючі агент, діючий незалежно від стадії клітинного циклу, - застосовується в хіміотерапії майже 50 років. Цитостатик метотрексат, антіметаболіт фолієвої кислоти, також давно використовується для лікування онкологічних та аутоімунних захворювань, таких як ревматоїдний артрит, де він як і раніше залишається В«ліками номер одинВ». Зв'язок між ліками та іншою частиною молекули проліків повинна легко гидролизоваться всередині клітини. Оскільки естерази володіють меншою специфічністю, ніж амідази, і широко представлені у всіх органах і тканинах, краща складноефірний зв'язок, а не амидная. Крім того, при розробці молекулярних структур ліпідних кон'югатів враховувалося їх найкраще відповідність упаковці ліпідного бішару ліпосом (рис. 1).
Рис. 3. Молекулярні структури ліпідних кон'югатів ліків і схематичне зображення лікарської ліпосоми
Ліпосоми з проліками формуються стандартним методом екструзії: ліпідні плівки, отримані із суміші всіх амфіфільних компонентів (яєчний фосфатидилхолін, фосфатіділінозіт з пекарських дріжджів і проліки), піддаються гідратації буферним розчином, потім 5-6 циклів заморожування (рідкий азот) - відтавання і нарешті, 10-20-кратної екструзії при температурі не вище +40 В° С через полікарбонатні мембранні фільтри з розмірами пор 100 нм. Для екструзії ми використовуємо установку фірми Lipex (Канада) при тиску азоту до 50 ат або ручний екструдер Avanti (США), в залежності від кількості необхідних препаратів. На рис. 2 наведені електронні мікрофотографії дисперсій ліпосом, отримані методом заморожування-сколювання, який найбільш адекватно відбиває розміри і структуру вихідних ліпосом в водній фазі [6].
Рис. 4. Електронні мікрофотографії реплік з поверхонь відколу заморожених дисперсій ліпосом, навантажених: А , а - ліпідним кон'югатів метотрексату; Б , б - ліпідним кон'югатів мелфалану
Очевидно, що ліпосоми, що містять до 10 мол. % Ліпофільних проліків, дійсно являють собою моноламеллярние везикули діаметром до 100 нм. Відомо, що фосфатіділінозіт стабілізує мембрану ліпосом, подібно залишкам полімеру в Stealth-ліпосоми. Ми вважаємо, що цей природний фосфолипид не повинен викликати небажані побічні ефекти, які супроводжують повторному застосуванню ліпосом з поліетиленгліколем [7].
Фізико-хімічна стабільність ліпосом досліджена нами за допомогою динамічного лазерного світлорозсіювання, електронної мікроскопії та гель-хроматографії в поєднанні зі спектрофотометричним аналізом на хромофори ліків та ліпідний фосфор. Показано, що пролекарства повністю (навантаження ліпідного бішару до 10 мол.%) вбудовуються в мембрану ліпосом і утворюють стабільні дисперсії, що містять лікарський початок в концентраціях, придатних для системного введення тваринам. Такі дисперсії можна зберігати кілька днів при +4 В° С. Однак самі ліки, в особливості залишок мелфалану, у водному середовищі піддаються поступової деградації. Для тривалого зберігання дисперсії можна заморожувати при -196 В° С і зберігати при температурах нижче -20 В° C; перед застосуванням їх необхідно розморозити і короткочасно обробити на ультразвуковий лазні. Дійсно, агрегати ліпосом, що утворилися після розморожування дисперсій (Рис. 3, б ), диспергуються з відновленням вихідних нанорозмірних ліпосом (рис. 3, в ).
Рис. 5. Електронні мікрофотографії ліпосом з ліпофільним проліками мелфалану (метод негативного контрастування):
а - через 20 год після отримання; б - після розморожування заморожених у рідкому азоті дисперсій; в - після обробки розморожених дисперсій на ультразвуковий лазні
Склад ліпосом при цьому також зберігається: ліпофільнеие пролекарства не виділяються з ліпідного бішару ліпосом в окремі агрегати [6]. Таким чином, глибоке заморожування без кріопротекторів може бути одним із способів тривалого зберігання ліпосомальних препаратів з ліпідними кон'югатів мелфалану та метотрексату.
Інший питання: яка стабільність складноефірний зв'язку ліпофільних проліків після внутрішньовенного введення ліпосомальних дисперсій? На прикладі кон'югату метотрексату нами показано, що проліків у складі ліпосом стійкі до передчасного гідролізу естеразами плазми крові людини [8]. Дійсно, високоефективна рідинна хроматографія зі спектрофотометричним детектуванням продемонструвала стабільність пролекарства метотрексату при інкубації in vitro в плазмі крові аж до 24 ч. Очевидно, ліпосоми захищають складноефірні кон'югати від дії позаклітинних естераз.
Проведена перша серія експериментів по вивченню фармакокінетики ліпосомального кон'югату метотрексату. У РОНЦ РАМН розроблений і широко застосовується в клініці метод аналізу фармакокінетики метотрексату і продукту його метаболізму 7-гідроксіметотрексата за допомогою високоефективної рідинної хроматографії. Дослідження, проведені нами на контрольній групі мишей СВАхC57Bl/6 (F1), показали, що фармакокінетика метотрексату при його внутрішньовенному введенні в еквівалентній дозі (10 мг/кг) значно відрізняється від такої для кон'югату метотрексату в ліпосоми. Відзначимо, що методика проведення хроматографічного аналізу кон'югату метотрексату до кінця не розроблена і має бути оптимізована. Тим не менш вже перші результати показують перспективність ліпосомального препарату. Наведемо деякі дані. Період напіввиведення кон'югату метотрексату, відповідний швидкої фазі розподілу по органах і тканинах, в дев'ять разів вище, ніж інтактного метотрексату (3,6 проти 0,4 хв). Період напіввиведення з плазми кон'югату перевищує майже в 3,5 рази показник для вихідного ліки (40 хв проти 12). Подальше освіта власне метотрексату зі пролекарства відбувається набагато більш повільно, в результаті його період напіввиведення значно збільшується і становить 196 хв у порівнянні з 12 хв при введенні інтактного ліки. Таким чином, ліпосомальний препарат є пролонгованої формою метотрексату. Наведені результати можуть свідчити про більш високий терапевтичному потенціалі нової лікарської форми метотрексату у вигляді дігліцерідного кон'ю...
